3 10 161 https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/39dd1833ac756eae39d3ff2b017fe40c.pdf 580cb04112f0314058bcc462b2431d2d PDF Text Text MANUAL DE PROCEDIMIENTO Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) Edición 2025 �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 6 Objetivos 6 Abreviaturas y definiciones 6 Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio 7 Principios de bioseguridad 7 Prácticas operativas seguras y hábitos personales 8 Limpieza y desinfección del laboratorio 10 Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) 10 Aseguramiento de la calidad en el laboratorio 10 Control de calidad de insumos 11 Equipos 13 Sobre la enfermedad 13 Descripción de la enfermedad 14 Infección por Brucella en ganado bovino 14 Infección por Brucella en ovejas y cabras 15 Infección por Brucella en cerdos 15 Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes 16 en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red 17 18 18 20 �Registro de entrada de muestras 20 Características y condiciones de las muestras 21 Condiciones de recepción de las muestras 21 Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las 21 muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) 22 23 para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo 23 Ejecución del ensayo de BPAT 23 Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala 24 Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de scree- 25 ning con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) 25 26 Desarrollo 26 Ejecución del ensayo 27 Incubación 28 Lectura e interpretación de resultados 28 Informes de resultados 30 Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME 31 Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos 31 Desarrollo 32 Toma de la muestra 33 Ejecución del ensayo 33 Lectura 33 Modificación de la prueba para tanques muy grandes 34 Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) 34 Etapas 35 Desarrollo 36 �ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos 38 38 41 contra brucella en suero Desarrollo 42 Ejecución del ensayo 42 Lectura e interpretación 43 Fijación de complemento 44 Desarrollo 44 Manejo y conservación de las muestras 45 Condiciones del ensayo 46 Ejecución 46 Lectura de resultados 48 Anexos 52 Bibliografía 68 �Introducción El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Estas técnicas son internacionalmente reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Objetivos • Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Redlab. • Proporcionar a la Redlab un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. • Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse cuando se desarrolle un procedimiento técnico. • Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Abreviaturas y definiciones • Ag: Antígeno • Biovariedad: bv • BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en placa • CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo • C’: Complemento de cobayo • DGLYCT: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico • DLA: Dirección de Laboratorio Animal • DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal • DT: Dilución de Trabajo • ELISA: Enzimoinmunoensayo • FCT: Fijación de Complemento Test • FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente • GR: Glóbulos Rojos • IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto • IgG: Inmunoglobulina G • IgM: Inmunoglobulina M • LPS: Lipopolisacárido • 2-ME: 2- Mercaptoethanol • M: Molar • mP: milipolarización MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 6 �• MRT (PAL): Prueba de anillo en leche • OMSA: Organización Mundial de Sanidad Animal • PAC: Poder anticomplementario • RBT: Rosa de Bengala Test • Renspa: Registro Nacional de Productores Agropecuarios • SAT: Seroaglutinación lenta en tubo • SB: Solución Buffer • Senasa: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria • SH: Sistema Hemolítico • UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro • UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro • UA: Unidad de Antígeno • UC: Unidad de Complemento • UH: Unidad de Hemolisina Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Se entiende por bioseguridad: La disciplina que trata el manejo seguro y la contención de microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos. La práctica del manejo seguro de microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación de los principios de contención y la evaluación de riesgos. Principios de bioseguridad El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos. Contención primaria: la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de Equipos de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de vacunas al personal cuando corresponda puede brindar un mayor nivel de protección del personal. Contención secundaria: la protección del medioambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas operativas. Por lo tanto, los elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Prácticas y técnicas de laboratorio: el elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 7 �estándares. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien informado acerca de las técnicas de laboratorio adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo. Cuando las prácticas de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento. El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del personal. Prácticas operativas seguras y hábitos personales • Limitar o restringir el acceso al laboratorio. • Diseñar el laboratorio para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos. • Seleccionar muebles de laboratorio con capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza. • Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos. • Adecuar la iluminación para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que pueda molestar la visión. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 8 �• Proveer mosquiteros para las ventanas del laboratorio que se abren hacia el exterior (en lo posible deberían ser fijas). • Usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas); además, usar calzado cerrado y cabello recogido. • Es obligatorio el uso de guantes cuando es probable que las manos entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados (puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes). Descartar los guantes cuando están contaminados y retirarlos cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar fuera del laboratorio. • No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo. • Utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial. • Lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I). • Almacenar los alimentos fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados con este único fin. • Está prohibido pipetear con la boca: utilizar dispositivos de pipeteo mecánicos. Aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes. • Llevar a cabo todos los procedimientos con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles. • Descontaminar las superficies de trabajo como mínimo una vez por día, luego de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable. • Descontaminar todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados antes de ser desechados mediante un método aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 9 �y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos. • El laboratorio debe tener las hojas de seguridad1 de cada sustancia química que utiliza en formato impreso y capacitar al personal sobre las mismas. Limpieza y desinfección del laboratorio Todo laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos para disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del lugar y volumen de trabajo. La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas, etc. Dentro de la limpieza se debe incluir el control de insectos y roedores. Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) El laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los residuos peligrosos ya que pueden causar daño, directa o indirectamente a seres vivos o contaminar el suelo, el agua, la atmósfera o el ambiente en general. Se consideran residuos patológicos/químicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a determinadas dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la salud, luego de estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía. Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en el lugar de generación de los mismos. Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: incineración, enterramiento por relleno de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a ese fin. Se ajustará a la normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio. Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (buenas prácticas de laboratorio), requisitos particulares del Senasa y la Norma ISO/IEC 17025 (última versión vigente) según la categoría del laboratorio. Es un documento que indica las particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado (en inglés, Material Safety Data Sheet o MSDS). El principal objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. Esta hoja o ficha contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales. 1 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 10 �Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados. Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser detectados para poder aplicar correcciones o acciones correctivas. Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos con la utilización diaria de sueros controles internos con títulos conocidos; mientras que el control externo –que se refiere al realizado por un laboratorio de referencia– se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad internos implementados. Respecto a la participación en ensayos interlaboratorios, los mismos deben ser provenientes de organismos reconocidos y programas de ensayos de aptitud. Se deben mantener documentados los resultados y, en caso de obtener resultados no satisfactorios, implementar las acciones correctivas pertinentes para su seguimiento y cierre. Del mismo modo podrán utilizarse otras herramientas a los fines de garantizar el desempeño adecuado y asegurar la calidad de los resultados de ensayo, como la confección de gráficos de control2. El control permanente de la calidad de los resultados junto con las buenas prácticas de laboratorio que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantiza el resultado confiable del diagnóstico. Control de calidad de insumos Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben ser establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo. La composición, el tipo de envase, la identificación y el lugar de almacenamiento deben ser los indicados en los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio. Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas. 2 Diagrama que sirve para examinar si un proceso se encuentra en una condición estable, o para asegurar que se mantenga en esa condición. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 11 �Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo deben utilizarse de acuerdo a las especificaciones del manual de procedimientos operativos correspondiente, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación. Los reactivos para el diagnóstico de brucelosis que se comercializan en la República Argentina, deben cumplir la normativa vigente del Senasa y aprobar el control de calidad de cada lote o serie indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de antígeno/kit que se utiliza con la fecha de uso. En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o pureza se encuentran establecidos sobre la base de diferentes normas o criterios, dependiendo de las instituciones u organismos internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran la American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes niveles de pureza del agua en función de los parámetros físico-químicos, tales como conductividad eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice. Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica. Especificaciones según ISO 3696 Parámetros Fisicoquímicos Grado 1 Grado 2 Grado 3 Conductividad eléctrica valor máximo a 25 ºC, µS/cm 0,1 1 5 Resistividad, MΩ 10 1 0,25 Absorbancia (UA a 254 nm) 0,001 0,01 -- Sílice Total valos máximo mg/l 0,01 0,02 1 pH -- -- 5,0 a 7,5 Clasificación de los tipos de agua según NC-ISO 3696: 2004 Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más exigentes, incluyendo la cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de una membrana con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice fundido). Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para análisis delicados, incluyendo la espectrometría de absorción atómica (EAA) y la determinación de componentes en cantidades mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u osmosis inversa seguida de destilación. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 12 �Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la preparación de soluciones de reactivos. Se puede preparar mediante una sola destilación, por desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo normal de análisis. Equipos El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el laboratorio. El equipamiento que afecte la calidad de los resultados de ensayo, debe mantenerse controlado, estipulando dentro de un programa los intervalos de control, calibración /verificación y mantenimiento de los mismos. Sobre la enfermedad3 Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones–humanas o animales– causadas por distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis) del manual de la OMSA. Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis) El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden Rhizobiales, en la clase alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la reaprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos relacionados con las seis especies de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las Fuente: Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad Animal -OMSA)- versión 2022. 3 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 13 �tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el reservorio natural de las mismas. Si bien solo se han descrito dos cepas de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado como nuevas especies de Brucella. Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción del microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo se encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos machos adultos pueden presentar orquitis/epididimitis y la brucelosis puede ser una causa de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por Brucella. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 14 �Infección por Brucella en ovejas y cabras La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causada principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva Zelanda. Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales de transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988). Infección por Brucella en cerdos La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B. suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis, pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis porcina puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de jabalíes. En general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la cópula también es frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días 50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infecMANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 15 �tados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones, cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6 meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al., 2012). La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en jabalíes parece ser alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares, sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres. Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos. Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis. Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano y el europeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el ganado bovino, ovino y caprino. La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje) se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos antropogénicos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 16 �Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son el hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por cohabitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y los caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microorganismos similares a B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado que son distintas de B. suis en función del perfil genético. Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos de tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor; a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden desarrollarse en casi cualquier lugar, a veces en el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos signos locales, como aborto, retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno, especialmente la médula ósea. Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Ciertas especies de Brucella, sobre todo B. melitensis, B. abortus, B. suis –y probablemente en menor medida B. canis– son fácilmente transmisibles al ser humano, en el que causan un proceso febril (fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones graves que afecten a los sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central. Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos constituye el principal riesgo para el MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 17 �público general en los lugares en los que la enfermedad es endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del riesgo biológico. Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS, 1953; OMS, 2004). Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos. Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos. Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se describen en este manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin embargo, los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico. Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FCT) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el ensayo de polarización fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 18 �En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado. Tabla 1 Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus, melitensis o suis (Manual OMSA, 2022). Propósito Método Demostrar ausencia de infección en la población Demostrar ausencia de infección en animales individualesa Contribuir a las políticas de erradicaciónb Confirmar casos clínicos sospechososc Determinar la prevalencia de la infección – vigilancia en el rebaño / manada Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones tras la vacunación - - Identificación del agente Métodos de tinción - Cultivo PCRd - - + +++ +/++ Detección de la respuesta inmune BBAT (RBT o BPAT) +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + +++ + +++ +++ + + + + ++ ++ ++ + +++ - +++ ++ +++ +++ ++ ++ + - Pruebas basadas en el NH y proteínas del citosole - - + ++ - - Prueba en leche de tanquef I- ELISA en leche o prueba de anillo en leche +++ - +++ + +++ - FPA CFT I-ELISA C-ELISA BST SAT Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad u otros factores limitan su aplicación; - = no adecuado para esta finalidad. PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de bengala] y BPAT [prueba de aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA = enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina; SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 19 �a Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por Brucella. b Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/ manadas, se recomienda combinar pruebas para aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o I- ELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST. c En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal. En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso en ausencia de signos clínicos. En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o BST. En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST. d Es posible que se obtenga falsos positivos. e En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev. 1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección. f Solo ganado lechero. Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y rechazo de muestras. Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta identificación, embalaje y documentación que acompaña a las mismas. Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con back- up), en el que figure como mínimo la siguiente información: • Fecha de recepción de muestras. • Cantidad de muestras. • Especie. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 20 �• Fecha de extracción de muestras. • Procedencia: establecimiento, número de Renspa. • Localidad: departamento, partido, provincia. • Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa. • Motivo del envío: • DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario). • MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus). • SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el Movimiento). • Control interno (según requerimiento de veterinario acreditado). • Remuestreo, otros. Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras: • Sangre entera o suero refrigerados • Suero congelado • Leche para PAL refrigerada (no congelada) • Leche para IELISA refrigerada/congelada • Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo • Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras: • Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) • Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la toma de muestra • Sangre entera congelada • Leche para PAL congelada, contaminada • Sangre entera o suero, contaminados • Sueros hemolizados • Tubos no identificados • Volumen insuficiente Los laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 21 �Informes de resultados Los informes que elabore el laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar adecuadamente las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo I del presente manual). En el informe de resultados debe constar: • Logo del laboratorio/Dirección/Tel./e-mail/ Número de identificación del laboratorio • N.° de protocolo interno • Fecha de extracción de muestras • Fecha de recepción de muestras • Fecha de informe o emisión de resultados • Cantidad de muestras • Especie • Procedencia: establecimiento, número de Renspa • Localidad: Departamento, partido, provincia • Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa • Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus), SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el movimiento), control interno (según requerimiento de veterinario acreditado), remuestreo • Columnas con la información del tubo / caravanas / edad / fecha de vacunación / pruebas utilizadas / resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME, ELISA, FCT, FPA), valor de corte e interpretación cuando corresponda • Información de los antígenos / kits utilizados • Firma del director técnico del laboratorio • Observaciones • Paginación x de y • Que conste en todas las páginas N.° del protocolo y N.° de Renspa Animales para examinar: Hembras vacunadas mayores de 18 meses y animales no vacunados mayores de 6 meses. Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de brucelosis en la República Argentina. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 22 �Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos IgM específicos. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio marcada con cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente. • La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para evitar la evaporación de las muestras. • Mezcladores de acero o plástico. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 º C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 ° C). • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. Reactivos: • Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%. • Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%. • Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Suero control interno positivo. • Suero control interno negativo. • Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Ejecución del ensayo de BPAT • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). • Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de ambos lados de la misma. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 23 �• Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 µl de suero, previo mezclado con vórtex. Utilizar un tip o punta de pipeta para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno. • Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro. • Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeneizar la mezcla. • Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa, permaneciendo la luz apagada. • Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos. A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura. Figura 2: Aglutinoscopio. Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala • Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT. • Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 µl de suero. Utilizar un tip para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero. • Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno, abarcando una superficie circular de aproximadamente 2 cm de diámetro. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 24 �• Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente. • Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco. En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OMSA recomienda utilizar la prueba de Rosa de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno. Lectura a los 4 minutos, como se detalla en la explicación anterior. Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aun siendo finos (no confundir con aglutinaciones inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de SAT / 2-ME, FPA, ELISA o FCT. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos. Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias. + - + Figura 3: Lectura BPAT/RBT - Informes de resultados Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas: Positivo Negativo + - POS NEG P N MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 25 �Criterios de aceptación del resultado En paralelo a las muestras problema se dispensan los sueros controles internos negativos y positivos. Para aceptar los resultados, ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si los controles no arrojan la lectura esperada, se deben revisar las posibles causas, calidad de los sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc. Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión. El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que causa un determinado grado de aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución. La prueba de 2-mercaptoethanol (2-ME) es una prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2-mercaptoethanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aun cuando las subunidades están integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación. La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos de la clase IgG. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente). El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de vidrio. • Probetas (100 ml y 1000 ml). • Pipetas 1, 2, 5 y 10ml. • Recipientes de vidrio de volúmenes variados. • Propipetas. • Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10 ml. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 26 �Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Balanza. • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. • Termómetro calibrado. Reactivos: 1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%.4 2. Suero control interno positivo. 3. Suero control interno negativo. Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Drogas y soluciones5: • Cloruro de sodio p.a. • Fenol p.a. • 2-mercaptoethanol p.a. • Solución salina al 0,85 %. • Solución salina fenolada al 0,5 %. Ejecución del ensayo Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera: • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC al menos una hora antes de la ejecución del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos de 10 minutos (no usar vórtex). • Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8 tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla con el número de protocolo. • Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema. En los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja un espacio libre y en los 4 tubos siguientes de la misma hilera, se realiza la prueba de 2-ME. • Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer tubo, 40 µl se distribuyen en el segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el cuarto. • Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de suero en los tubos de 2-ME. 4 Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar porque esto lo inutiliza al modificar la sensibilidad. 5 Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 27 �• Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo, además de un control de soluciones y antígeno sin suero. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución de 2-ME (0,1 M) en cada tubo de este grupo y mezclar muy bien agitando la gradilla. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución salina fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT. • Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y, posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno de SAT diluido al 2 % (0,09 % de brucelas) en solución salina 0,85 %. • Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa. Consideraciones generales: • Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse por las técnicas de SAT y 2-mercaptoethanol, ELISA, FPA o FCT. • La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación en tubo, no solo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción de la aglutinación específica de la unión antígeno-anticuerpo. Incubación La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 horas y tiene por objeto obtener en el tiempo más corto posible el máximo de aglutinación. Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la estufa durante el transcurso de las 40-48 horas de la incubación, para verificar la estabilidad de la estufa. Lectura e interpretación de resultados Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las pruebas contra el fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz que atraviese los tubos. La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el fondo del tubo por gravedad determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo; después de una leve agitación del tubo, se mantienen los grumos firmes. La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar tanto en la claridad/turbidez de las MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 28 �mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los grumos al agitar suavemente el tubo. El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa aglutinación en el tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la turbidez y los grumos firmes se mantienen a pesar de una agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI / ml de aglutinación en SAT o en 2-ME. El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo (+), incompleto (I) o negativo (-). • Aglutinación completa es aquella en que el líquido de la mezcla suero-antígeno aparece límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos. • Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una suave agitación no rompe los grumos. • Negativa es aquella en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida aparece turbia y una suave agitación no revela grumos. Fenómeno de zona En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas, pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada “fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el suero en las diluciones más bajas, lo que provoca una aglutinación no visible por estar fuera de la zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 29 �Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME. Informes de resultados Ejemplo: Negativo Neg I 25 25 1/25 I: Incompleto Tabla 2 Interpretación de los resultados para hembras bovinas mayores de 18 meses de edad vacunadas con Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH * NH NEGATIVO + ≤ 50 - NEGATIVO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - SOSPECHOSO + I 200 - SOSPECHOSO + 200 - POSITIVO + 25 a 50 I 25 NEGATIVO + ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO + ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO * NH: No se hace MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 30 �Tabla 3 Interpretación de los resultados para animales no vacunados (bovinos y otras especies) mayores de 6 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH NH NEGATIVO + 25 - NEGATIVO + I 50 - SOSPECHOSO + 50 - SOSPECHOSO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - POSITIVO + 200 - POSITIVO + ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Solución salina 0,14 m • Cloruro de sodio 8,5 g • Agua destilada 1000 ml Solución salina fenolada Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. Solución 2-ME 0,1 m • 2-Mercaptoethanol 7,8 ml • Solución salina 0,14 M. 992,2 ml Importante: no utilizar solución salina fenolada El 2-mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire. Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en lo posible con máscara de gases o en cabina de extracción. Nunca pipetear con la boca. La solución de 2-mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una semana a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. • Solución de antígeno SAT (wright) al 2 % • Solución salina 0,14 M (no utilizar solución salina fenolada) 98 ml • Antígeno SAT (wright) (4,5 %) 2 ml MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 31 �La solución de antígeno al 2 % se puede conservar por una semana en heladera (5 ± 3 ºC). Descartar toda aquella solución que presente turbidez o signos de contaminación. Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos La prueba se diseñó para detectar la presencia de anticuerpos en leche de bovinos. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie, de esta manera forma una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural. Esta prueba se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la brucelosis. El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso. Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las pruebas serológicas para identificar aquellos infectados. Desarrollo Materiales: • Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de Khan de vidrio claro y completamente limpio. • Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. • Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml. • Gradillas. • Timer. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Termómetro calibrado. Reactivos: • Antígeno PAL con volumen celular aprox.4 %. • Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Muestras de leche refrigerada (no congelada). • Solución de formalina 1 %. • Muestras de leche controles positivo y negativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 32 �Ejecución del ensayo Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura de 5 ± 3 ºC hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas). No deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta ni conservadas durante más de 72 horas. • Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (no usar vórtex). • Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100 mm o tubo de Khan. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. • Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes. • Incubar en estufa a 37 ± 2 º C, durante una hora. Lectura - Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul. + Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual. ++ Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche. +++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color. ++++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca. Cualquier grado de + debe interpretarse como positivo. Observaciones • El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba. También, la agitación vigorosa dificulta su realización. • El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba no se puede efectuar con leches pasteurizadas. • Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la leche, se pueden obtener algunos resultados falsos positivos o dudosos. • La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos. • La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la interpretación de la prueba debido al descoloramiento del antígeno. • La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos positivos. • Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 33 �Modificación de la prueba para tanques muy grandes Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche manteniendo constante la cantidad del antígeno (30 µl). Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (2 o 3 ml de leche), se añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada al tubo de ensayo y, a continuación, 30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la misma forma que para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis. < 150 vacas 1 ml de leche 150 – 450 vacas 2 ml de leche 451- 700 vacas 3 ml de leche Figura 5: Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras de pool de leche. Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis en la República Argentina con el valor de corte establecido por el Senasa. El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de “señal” que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 34 �hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular. Etapas Previo al inicio de la ejecución del ensayo, equilibrar todos los componentes del kit a temperatura del laboratorio. 1. Adición en cada pocillo de los controles y sueros/leche problemas en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos, estos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 2. Incubación. 3. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o uniones inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del ensayo. 4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti IgG de especie), los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 5. Incubación. 6. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado. 7. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 8. Adición de la solución de frenado. 9. Lectura colorimétrica de la placa. Figura 6: Esquema ELISA indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 35 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450 nm). • Computadora. • Agitador orbital de placas. • Lavador manual o automático de placas. • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 ºC). • Estufa de incubación (37 ± 2 ºC). • Vórtex. • Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada). • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10 µl, 5 - 50 µl, 50 -200 µl, 200 - 1000 µl). • Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl). • Propipetas. • Dispensadores automáticos. • Timer. • Selladores de placas de acetato o parafilm. • Cubetas plásticas para pipetas multicanales. • Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o placas fondo en U. • Criotubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros. • Gradillas. • Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc., de distintos volúmenes). • Toallas o papel absorbente. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa y contienen: • Buffer de lavado • Buffer de dilución • Conjugado • Sustrato cromógeno • Solución de frenado • Sueros controles • Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 36 �Precauciones para tener en cuenta al ejecutar la técnica de Elisa: • Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos. • Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de su utilización. • No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits. • Evitar cualquier contaminación de los reactivos. • No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad. • Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo. • Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación / dilución de los reactivos que se empleen en el ensayo. • Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo. • Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador. • Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice el kit. • El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se recomienda retirar del frasco únicamente el volumen que se vaya a utilizar y nunca devolver el sustrato sobrante al frasco original. • La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la piel lavar inmediatamente con abundante agua. Figura 7: Placa de Elisa. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 37 �ELISA por competición / bloqueo La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una matriz sólida (microplaca de 96 pocillos). A continuación, se añade la dilución de los sueros y el anticuerpo monoclonal, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos junto con el antígeno adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo antimonocolonal conjugado con enzima. Es importante mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero normal (no infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies. La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato/cromógeno. Después de un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos del ensayo la placa debe ser lavada debidamente. En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el anticuerpo monoclonal se liga con el epitope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos anti Brucella (suero positivo), estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epitope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos posvacunales por B. abortus cepa 19 compiten en menor grado con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja, lo que usualmente resulta en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores al sangrado). Diversos CELISA/bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras contengan anticuerpos frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen este tipo de anticuerpos, el conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa. Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato adecuado, el cual desarrollará una reacción colorimétrica en presencia de la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con enzima). De este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra evaluada no contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y la ausencia de color indicará que la muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos. Desarrollo Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación de las muestras: Idem Elisa indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 38 �Figura 8: CELISA. Tabla 4 Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA Señal Posible causa Solución 1. Error de pipeteo 2. Falta de mezcla de reactivos 3. Falta de lavados Práctica Mejorar técnica Precaución 1. Se omitió el substrato 2. Concentración substrato errónea Revisar Revisar 3. Conjugado muy diluido 4. Se omitió el conjugado Revisar Revisar Color parejo en toda la placa 1. Conjugado muy concentrado 2. Falla en el lavado 3. Substrato contaminado Controlar Mejorar técnica Revisar Elevado color de fondo “background” 1. Reacción inespecífica 2. Material de vidrio sucio 3. Agua de mala calidad Cambiar solución de lavado Mejorar lavado Controlar calidad Desarrollo de color muy rápido 1. Substrato muy concentrado 2. Conjugado muy concentrado Revisar Controlar dilución Desarrollo de color muy lento 1. Substrato muy diluido 2. Conjugado muy diluido 3. Concentración cromógeno errónea Revisar Revisar dilución Revisar Efecto borde 1. Incubación despareja 2. Resecación por aire 3. Tampón de lavado residual Utilizar estufa Mantener la placa cubierta Eliminarlo Color irregular No hay color MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 39 �Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 40 �Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero El ensayo de polarización fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella tiene la capacidad de ser una prueba multiespecies, lo que permite el diagnóstico presuntivo en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y bisontes. Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con Brucella de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de los 3 meses posvacunación aproximadamente, y de los animales con reacción cruzada con bacterias gramnegativas en más del 90% de los casos. A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un tubo de vidrio. A continuación, la muestra es equilibrada por aproximadamente cinco minutos, posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador fluorescente para obtener una lectura blanco de referencia (autofluorescente). A continuación, el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) es agregado a la solución y luego la muestra es equilibrada nuevamente por un mínimo de dos minutos para permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen. La muestra es leída nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos anti Brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP. El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina se ha determinado en: Bovinos: • Animales negativos: < 94 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 94 mP y 104 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP. Caprinos y porcinos: • Animales negativos: < 85 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 85 mP. Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis): • Animales negativos: < 80 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 80 mP y 90 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 91 mP. Se modifica el valor de corte en la especie ovina (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis) con una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 95 %. Programa GraphPad Prism. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 41 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de polarización fluorescente. • Vórtex. • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10 µl, 20 –200 µl, 200– 1000 µl). • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 º C). • Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm. • Material de vidrio. • Termómetro de temperatura ambiental. • Computadora e impresora. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa e incluyen: • Buffer de dilución. • Sueros controles positivo y negativo. • Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceína. Ejecución del ensayo Preparación de los reactivos Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial. Preparación del equipamiento/instrumentos El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos los equipos previos a la ejecución del ensayo. Preparación de la prueba En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con lo especificado en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los sueros controles no se ajusta dentro de los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado. Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por lo menos dos (2) horas antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso: • Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 10 µl de suero bovino (dilución 1/100) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex evitando la formación de espuma. • Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex. • Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros. • Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 42 �• Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se estabilice. • Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las muestras. • Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y mezclar bien con vórtex. Es importante evitar la formación de espuma en la muestra. En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas partículas hayan sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas pueden interferir con la lectura de la muestra dado que la misma se basa en el peso molecular de las partículas en suspensión. • Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos minutos. • Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas. Figura 10: Esquema ensayo de polarización fluorescente. Lectura e interpretación Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del kit utilizado según el control de calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo. Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización (mP) de la actividad del suero contra el antígeno. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Aceptación de los controles Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será rechazada y los controles y las muestras deben ser repetidas. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 43 �Fijación de complemento La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional para el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina. La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos “capaces de fijar” el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de “Animal infectado”. La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente. La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera, el antígeno y el suero problema (cuyo complemento se destruyó previamente por calentamiento a baño maría) se incuba en presencia de complemento de cobayo. Después de dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un “sistema indicador” o “sistema hemolítico” formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como complejo antígeno-anticuerpo alternativo. La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmunocomplejos en la primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de sus factores. En la segunda etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante la presencia del “sistema hemolítico”. El resultado es la ausencia de hemólisis (resultado positivo). Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es indicadora de la existencia de complemento libre en la segunda etapa de la reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmunocomplejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo). Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2 %, 2,5 % o al 3 %). Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina) hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100 % de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo. Desarrollo Materiales: • Tubos de ensayo. • Material de vidrio de volúmenes varios. • Gradillas. • Film para cubrir placas. • Puntas de pipetas (tips). • Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. • Cubetas o reservorios de plástico para reactivos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 44 �Equipos: • Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a 5000 µl. • Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl. • Centrífuga. • Centrífuga de placas. • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 °C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Agitador de microplacas. • Vórtex. • Baño térmico. • Espectrofotómetro. Reactivos: • Solución buffer: Ver Anexo FCT I Solución GR 2%: ver Anexo FCT II Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III Sistema hemolítico Anexo FCT IV • Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V Titulación Antígeno: Ver Anexo FCT VI Sueros controles: • Suero control positivo bovino. • Suero control negativo bovino. Manejo y conservación de las muestras • Conservar los sueros en heladera (5 ± 3 º C) no más de dos días, para períodos mayores, conservarlos a –20 ± 5 º C. • Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento. • No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis. • Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos. Inactivación de los sueros Los sueros controles y las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2 ºC para eliminar el complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño termostático se controla mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de exposición de las muestras. - Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre 60 - 63 °C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación de 30 minutos). - Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. Volumen de suero sugerido para inactivar: 200 µl. - La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejan a tem- MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 45 �peratura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 horas, las muestras ya inactivadas se conservan a -20 ± 5 ºC. Condiciones del ensayo El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2 º C) y se utilizan los siguientes reactivos en volúmenes de 25 µl: a. Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB. b. Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100 %). c. Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo. d. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una solución de suero hemolítico en SB que contenga 2UH (100 %) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero en SB al 2 %. Ejecución Dependiendo del número de muestras que se realizarán, se podrán incluir los controles en la misma placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles. Dilución de las muestras de suero El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U, mediante la utilización de volúmenes de 25 μl. La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Suero 25 µl 25 µl de la dilución 1/2 25 µl de la dilución 1/4 25 µl de la dilución 1/8 25 µl de la dilución 1/16 25 µl de la dilución 1/32 25 µl de la dilución 1/64 25 µl de la dilución 1/128 SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl Sueros controles Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización de volúmenes de 25 μl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla en la tabla 2. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 2 1/12,5 1/25 Suero positivo 01/05 25 µl SB - 25 µl 25 µl 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 25 µl de la dilución 1/25 25 µl de la dilución 1/50 25 µl de la dilución 1/100 25 µl de la dilución 1/200 25 µl de la dilución 1/400 25 µl de la dilución 1/800 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 46 �Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.). Controles del ensayo a. Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado en la placa 25 μl/pocillo de SB, 25 μl/pocillo de C y 25 μl/pocillo de antígeno. b. Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 50 μl/pocillo de SB y 25 μl/pocillo de C. c. Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 75 μl/pocillo de SB. Disposición de los sueros en la placa Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo en U (25 µl/pocillo) según indica la tabla 3. Tabla 3 1 Control positivo 2 Control negativo 3 muestra 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/12,5 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 B 1/25 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 C 1/50 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 D 1/100 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 E 1/200 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 F 1/400 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 G 1/800 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 H 1/1600 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento • Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras. • Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control negativo) y 1/12,5 (control positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder anticomplementario (PAC) de cada suero. Primera incubación en caliente • Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Dispensado del sistema hemolítico • Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e incubar a 37 ± 2 ºC durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo FCT IV. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 47 �• Finalizada la primera incubación, dispensar 25 μl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los pocillos de las placas incluida la placa de los controles. Segunda incubación en caliente • Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos o bien dejarla en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura. Lectura de resultados El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos) de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción positiva se cuantificará mediante la determinación del título y su grado de hemólisis. Reacción positiva • Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo. • El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y consignarse mediante un sistema de cruces. Figura 11: Placa fijación de complemento. ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botó de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 48 �Determinación del título del suero Será la inversa de la dilución más alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este grado de fijación será informado mediante el sistema de cruces descripto y convertido a UIFCT. - En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier valor ≥ 40 UIFCT (1/8 ++). - Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo cualquier valor ≥ 20 UIFCT (1/4 ++). Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón internacional OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se basa en el “Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis” (Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia) y el “Manual de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario” (Gobierno de Aragón. España. Tabla 4). Tabla 4 Interpretación en UIFCT Dilución % de Fijación del Complemento 1000 UIFCT (1/200) + ++ +++ ++++ 16,6 20 23,2 26,6 1:8 + ++ +++ ++++ 33,2 40 46,4 53,2 1:16 + ++ +++ ++++ 66,4 80 92,8 106,4 + ++ +++ ++++ 132, 8 160 185,6 212,8 1:64 + ++ +++ ++++ 265,6 320 371,2 425,6 1:128 + ++ +++ ++++ 531,2 640 742,4 851,2 + ++ +++ ++++ 1062,4 1280 1484,8 1702,4 1:4 1:32 1:256 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 49 �Controles del ensayo La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados: Controles Resultado esperado Suero control positivo 50 % de fijación (++) en la dilución 1:200 que corresponde a 1000 UIFCT (Brucellas lisas) Suero control negativo 100 % de hemólisis en todos las diluciones, ausencia de fijación de complemento Control de poder anticomplementario de los sueros 100 % de hemólisis ausencia de fijación del complemento en la dilución 1:2 (sin antígeno) Control de ausencia de poder anticomplementario del antígeno 100 % hemólisis Control del sistema hemolítico sin C 0 % de hemólisis Control del sistema hemolítico con C 100 % de hemólisis Criterio de aceptación del análisis: El ensayo se debe considerar APROBADO/NO APROBADO a) APROBADO: • Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento dan los resultados pre-establecidos. • El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con una variación máxima de (± 2 ++). • El control negativo da un resultado Negativo. b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se repite el ensayo. La presencia de, al menos, un 25 % de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A (dilución ½) indica poder anticomplementario en la muestra. En este caso, se informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción de la toma de muestra. Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar una escala visual del siguiente modo: • En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 900 µl de SB 1X. • En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 700 µl de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR (solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X para mantener la presión osmótica. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 50 �Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0 % de hemólisis y el 100 % de hemólisis en la prueba. De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS Reactivos en µl 0% Solución hemolisada Suspensión de glóbulos rojos 0 100 10 % 10 90 20 % 20 80 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % 80 % 90 % 30 40 50 60 70 80 90 100 60 50 40 30 20 10 0 70 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 100 % 51 �Anexos MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 52 �Anexo FCT I: Solución Buffer (SB) Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1, luego conservar en refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez producto de contaminación. Solución de stock calcio 0,3 M y magnesio 1 M Ca Cl2. Mg 3,7g Cl2. 9,5 g Agua destilada 100 ml • Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85 % (NaCl2 8,5 g/agua destilada 1 litro). • La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 - 7,4. • Luego de su uso, conservar en refrigeración por 7 días. II: Preparación de la suspensión de GR 2 % a) Lavado de los GR 1. Homogeneizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos. 2. En un tubo cónico resuspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5 volúmenes de SB, luego homogeneizar cuidadosamente. 3. Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 4. Repetir la resuspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente descripta y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 5. Realizar la última resuspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 10 minutos. 6. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante, el cual debe estar libre de hemólisis. 7. El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2 % se podrá realizar por medio de dos técnicas. • Método espectrofotométrico. • Método en cámara de Neubauer. Método espectrofotométrico: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5 ml agua destilada en la celda o tubo del espectrofotómetro. 3. Determinar la lisis 100 % de los GR realizando una dilución 1/15 con agua destilada, agregando en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 53 �4. Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm. 5. La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar según el modelo de espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la concentración de GR al 2 %. Método en cámara de Neubauer: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlos en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la cámara. 3. La suspensión deberá tener 5,4 (± 0,2) X 108 GR / ml. III: Titulación Hemolisina Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex. Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina N.° de tubo Dilución SB (ml) Hemolisina 1 1/50 4,9 100 µl 2 1/100 2 2 ml T1 3 1/150 7,45 50 µl 4 1/200 1 1 ml T2 5 1/250 12,5 50 µl 6 1/500 1 1 ml T5 7 1/1000 6 2 ml T5 8 1/2000 1 1 ml T7 9 1/3000 2 1 ml T7 10 1/4000 3 1 ml T7 11 1/5000 4 1 ml T7 12 1/6000 5 1 ml T7 13 1/7000 3 0,5 ml T7 14 1/8000 3,5 0,5 ml T7 15 1/9000 4 0.5 ml T7 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 54 �Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina • En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo de SB excepto de las columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2). • En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la batería de tubos de ensayo, según protocolo de la tabla 1. • Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se realiza mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl / pocillo de la fila B y pasar a la fila. • Volver a homogenizar. Recoger 25 µl / pocillo de la fila C y pasar a la D. Homogeneizar y recoger 25 µl / pocillo y descartar. • De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H. • Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 550 µl 50 µl 50 µl de T1 de T1 de T1 de T2 de T2 de T3 de T3 de T4 de T4 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 10 11 12 E F G H 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T5 de T5 de T6 de T7 de T8 de T9 de T10 de T11 de T12 de T13 de T14 de T15 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS SB 55 �Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/50 1/50 1/100 1/100 1/150 1/150 1/200 1/200 B 1/100 1/100 1/100 1/200 1/200 1/300 1/300 1/400 1/400 C 1/200 1/200 1/200 1/400 1/400 1/600 1/600 1/800 1/800 D 1/400 1/400 1/400 1/800 1/800 1/1200 1/1200 1/1600 1/1600 F 1/250 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/3000 1/4000 1/5000 1/6000 1/7000 1/8000 1/9000 G 1/500 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/6000 1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000 H 1/1000 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000 E Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos Se prepara una suspensión de GR al 2 % según lo indicado anteriormente. En este ensayo se prepara una suspensión de 5 ml. 1. Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca. 2. Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos a bajas revoluciones. Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión con los anticuerpos presentes en las diluciones de hemolisina). 3. Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se dispensan adicionalmente otros 25 µl (esta columna actúa como control del poder hemolítico de la hemolisina). Preparación y dispensado de una solución de complemento El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que siempre haya reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) Ac (hemolisina diluida). Para complementos (comerciales) que den un título (unidad de complemento) superior a 1/90, debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que den títulos inferiores, la solución que se deberá preparar será de 1/10 - 1/20 (tabla 4). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 56 �Tabla 4: Dilución del complemento TV Complemento Solución de complemento 1/20 5,7 ml 0,3 ml Solución de complemento 1/30 5,8 ml 0,2 ml 1. Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C, D, F, G y H, excepto en los pocillos de la columna 1. 2. Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Incubación Incubar a 37 ± 2 ° C, durante 30 minutos. Cálculos y expresión de resultados El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consigna mediante un sistema de cruces (tabla 5). Tabla 5: Expresión de resultados ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente. Cálculos de los resultados • Se define la unidad de hemólisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. • Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de hemólisis presentan un grado de hemólisis similar. • Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor concentración de hemolisina). • La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir 2 UH 100 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 57 �Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000 DT= 2 x 1/1000= 1/500 • Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas de trabajo. • Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5 º C para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote, fecha y cantidad de hemolisina diluida. IV: Sistema hemolítico • Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema depende del número de placas que se deberán utilizar (1 placa= 96 pocillos fondo en U). Ejemplo para dos placas: 2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de perdidas) • Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2 % y luego 2,5 ml de hemolisina al título de uso agitando suavemente para homogenizar las dos suspensiones e incubar a 37 ± 2° C, durante 15 minutos. V: Titulación complemento Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema enzimático denominado ‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de fijación del complemento es la de detectar uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean glóbulos rojos, es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la reacción de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el papel de antígeno y el suero de conejo (hemolisina) de anticuerpos. El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo llevar a temperatura de laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacará de la heladera en el momento de su utilización. Si se prevé que se va a utilizar más de un vial, se juntarán todos en uno y se titulará el conjunto. Preparación de las soluciones “madres” del complemento 1. Realizar 6 diluciones “madres’’ del complemento, empleando para ello tubos de ensayo. Tabla 1 de este anexo. 2. En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se homogeneiza perfectamente mediante un agitador. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 58 �Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 SB µl 725 850 975 1100 1225 1350 C µl 25 25 25 25 25 25 Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB 1. En la filas B, C y D de una placa fondo en U, dispense 25 µl/pocillo de SB (tabla 2). 2. En la filas A de la placa, dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de complemento por duplicado según protocolo descripto en tabla 1. 3. Con una pipeta multicanal, recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a la fila B. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se propiciará mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensación de la pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila. 4. Vuelva a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogenice y recoja 25 µl/pocillo y descártelos (las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3). 5. Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa. 6. Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB E F G H MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 59 �Tabla 3. Diluciones finales del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 B 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 C 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 D 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 E F G H Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 15 minutos. Dispensado del sistema hemolítico El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto anteriormente. 1. Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl / pocillo del SH en todos los pocillos de la placa. 2. Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. 3. Incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 60 �Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces: Tabla 4 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de complemento (UC) o unidad hemolítica como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UC con la dilución más alta que de 100 % de hemólisis. 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC. Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el análisis de 2 placas según el procedimiento descripto. Ello supone un volumen total de solución de complemento de 2 placas x 2,4ml / placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de pérdidas). a. Supongamos que UC = 1/100 DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50 Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro: En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml b. Por tanto las proporciones serán: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml de SB. Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 61 �Control de dos unidades de complemento (2 UC) Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizarán diluciones del complemento que contengan 2 unidades; 1,5 unidades; 1 unidad; 0,75 unidades y 0,5 unidades. Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia (tabla 5). Tabla 5. Diluciones del complemento Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 Se dispensarán por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en los correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de SB (tabla 6). Tabla 6. Unidades del complemento en la placa 1 2 3 4 5 A 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U B 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U 6 7 8 9 10 11 12 C D E F G H 1. Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2-4 minutos e incube en estufa a 37 ± 2 ° C durante 15 minutos. 2. Luego repita lo descripto agregando el SH Lectura del análisis: • Pocillo con 2 unidades: 100 % de hemólisis • Pocillo con 1,5 unidades: 100 % de hemólisis MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 62 �• Pocillo con 1 unidades: 100 % de hemólisis o traza de GR en suspensión • Pocillo con 0,75 unidades: 0 % a 75 % de hemólisis • Pocillo con 0,5 unidades: 0 % a 50 % de hemólisis Control de calidad El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un grado de reacción similar. En caso contrario se repetirá el análisis. Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el 100 % (N) de hemólisis (las más bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de hemólisis (las más alta). En caso contrario se repetirá el análisis. En el control de 2 unidades de complemento deben dar los resultados preestablecidos. El análisis debe informarse como APROBADO / NO APROBADO en el apartado de observaciones de la planilla de titulación del complemento. En caso de no aprobado, se repite el proceso. VI: Titulación antígeno Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 %. Se trata de determinar lo que se denomina UA (unidad antigénica) que corresponde para cada lote de antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los sueros problema, en la cantidad suficiente para fijar el complemento. El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros problema y que serán capaces de fijar el complemento. Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento. Preparación de diluciones “madre” de antígeno Se preparan tres diluciones previas en tubos, luego se dispensarán: • en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un tercer tubo 1250 µl de SB y 10 µl de antígeno. Esto da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125, respectivamente. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 63 �Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno En una placa de fondo en U se dispensan 25 µl de SB en todos los pocillos salvo en la columna 1 y los pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizarán hasta la columna 9 (tabla 1). En la columna 1 se pondrán 50 µl de las soluciones madres del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de forma simple (tabla 1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la columna 1 a la columna 9 y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10, H11 y H12. Es decir, se pasan 25 µl de la columna 1 a la 2, se homogeniza y se pasan otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente, y se eliminan los 25 µl que sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12. Tabla 1. Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno 1 2 3 4 5 6 7 A 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 B 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 8 9 10 11 12 1/6400 1/12800 1/50 1/75 1/125 1/6400 1/12800 1/100 1/150 1/250 1/200 1/300 1/500 C D 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/400 1/600 1/1000 E 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/800 1/1200 1/2000 1/1600 1/2400 1/4000 1/8000 F G H 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/3200 1/4800 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/6400 1/9600 1/16000 Dispensado de sueros controles positivo y negativo Seguidamente se dispensan 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la fila A, B, D, E, G y H salvo en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl de suero control negativo y servirá como control de hemolisis. El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en la reacción de fijación del complemento. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 64 �Dispensado de una solución de complemento Posteriormente se dispensan 25 µl de complemento a todos los pocillos según el título obtenido previamente. Se agita la placa 2-4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37 ± 2°C. Dispensado del sistema hemolítico Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos. Luego se agita la placa 2-4 minutos e incubará durante otros 30 minutos a 37 ± 2°C. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces. Tabla 2 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un depósito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un depósito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un depósito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 65 �Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación completa (0 % de hemolisis). 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de antígeno presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor concentración de antígeno). 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA. Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800: DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 66 �Anexo I Modelo de planilla de emisión de resultados MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 67 �Bibliografía MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 68 �Normativa vigente Ley 24.696 de año. Por la cual se declara de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio Nacional. 26 de septiembre de 1996. B.O. N.º 28.492. Norma Organización Internacional de Normalización [ISO/IEC 17025]. 2017 (España). Resolución 957 de 2024 [Senasa]. Por la cual se aprueba el uso de los inmunógenos RB51 y Delta PGM. 15 de agosto de 2024. Resolución 276 de 2023 [Senasa]. Por la cual se adopta el sistema de diagnóstico serológico para el Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la República Argentina. 14 de abril de 2023. Resolución 77 de 2021 [Senasa]. Por la cual se sustituye el articulo 9° y 10 de la Resolución N.° 67/19 y otras modificaciones. 19 de febrero de 2021. Resolución 67 de 2019 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional De Control y Erradicación De Brucelosis Bovina en la República Argentina, de aplicación obligatoria en todo el territorio nacional, excepto en la provincia de Tierra Del Fuego, Antártida e islas del Atlántico Sur. 1.° de febrero de 2019. Resolución 857-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se declara como zona libre de brucelosis ovina y caprina a Brucella melitensis, a la región patagónica y se establece el Programa De Vigilancia y Prevención. 27 de diciembre de 2017. Resolución 372-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional de Control de Brucelosis Caprina en la República Argentina y se establecen las estrategias sanitarias básicas que deben ser aplicadas en cada zona o provincia. 14 de junio de 2017. Resolución 98 de 2016 [Senasa]. Por la cual se resuelve la comercialización de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis.18 de marzo de 2016. Resolución 63 de 2013 [Senasa]. Por la cual se crea el Registro Nacional de Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina. 28 de febrero de 2013. Resolución 246 de 2007 [Senasa]. Por la cual se aprueban los requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se dediquen a la elaboración de productos destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis Animal y la Tuberculosis Animal. 04 de mayo de 2007. Resolución 438 de 2006 [Senasa]. Por la cual de adopta el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. 4 de agosto de 2006. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 69 �Resolución 736 de 2006 [Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos]. Por la cual se crea la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. 17 de noviembre de 2006. Resolución 79 de 2003 [Senasa]. Por la cual se aprueba el procedimiento para la supervisión de la aplicación de los tratamientos de fumigación oficial. 26 de enero de 2003. Resolución 1484 de 1993 [Senasa]. Por la cual se establecen las normas para la elaboración, fraccionamiento, distribución, expendedor para los reactivos destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal. 28 de diciembre de 1993. Bibliografía consultada Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D. and Verger, J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. INRA, Paris. Angus, R.D. & Barton, C.E. (1984). The production and evaluation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand. (56,349-356). Centro Panamericano de Zoonosis (1968). Técnicas e interpretación de sero-aglutinación para el diagnóstico de la brucelosis bovina. Nota Técnica Nº2. Ramos Mejía. Ciocchini A.E., Rey Serantes D. A., Melli L.J., Iwashkiw J.A., Elena S., Franco C., Nicola A.M., Feldman M.F., Comerci D.J., Ugalde J.E. (2014) A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigenic target for diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol. 172 (3-4):455-65. Cortina M.E., Balzano R.E., Rey Serantes D.A., Caillava A.J., Elena S., Ferreira A.C., Nicola A.M., Ugalde J.E., Comerci D.J., Ciocchini A.E (2016). A bacterial glycoengineered antigen for improved serodiagnosis of porcine brucellosis. Journal of Clinical Microbiology. 54(6), 1448-1455. Gall D., Nielsen K., Forbes L., Cook W., Leclair D., Balsevicius S., Kelly L.,Smith P. & Mallory M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37,110-118. Gall D.,Nielsen K.,Forbes L.,Davis D.,Elzer P.,Olsen S.,Balsevicius S.,Kelly L., Smith P., Tan S. & Joly D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J. Wildl. Dis., 36, 469-476. Bagnat, Moras, Vibot, Samartino, T. De Echaide, Walsh, Diprodesa, Di Lorenzo, Nicola (2006). Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis. Macmillan A.P., Greiser-Wilke I., Moennig V. & Mathias L.A. (1990). A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. DtschTierarztl. Wochenschr. (97, 83-85). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 70 �Lucero, N., Escobar, G., Ayala, S., Hasan, D. (2008). Manual de Procedimientos Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana. Servicio de Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”, Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur, Buenos Aires. Nielsen K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol. (90,447-459). Nielsen K., Gall D., Jolley M., Leishman G., Balsevicius S., Smith P., Nicoletti P. & Thomas F. (1996). A homogenous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus. J. Immunol. Methods (195,161-168). Nielsen K., Kelly L., Gall D., Balsevicius S., Bosse J., Nicoletti P. & Kelly W. (1996). Comparison of enzymeimmunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet. Med. (26, 17–32). Nielsen K., Kelly L., Gall D., Nicoletti P. & Kelly W. (1995). Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet.Immunol.Immunopathol. (46,285-291). Organización Mundial de la Salud (2009). Manual técnico de referencia para la higiene de las manos. Senasa (2019). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires. Senasa (2009). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires. Senasa (1998). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires. Silva Paulo, P.; Vigliocco, A.M., Ramondino, R., Marticorena, D., Bici, E., Briones, G., Gorchs, C., Gall, D., Nielsen, K. (2000). Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol. (7, 828-831). Stack J.A., Perrett L.L., Brew S.D., Macmillan A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples. Vet. Record (145, 735-736). Szyfres, B. (1983). El Diagnóstico de la brucelosis bovina en el contexto de un programa de lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA. Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone, A., Marchesino, M., Nielsen, K. (1998). Evaluation of an Indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet. Med. (36, 211-217). Vanzini, V., Echaide, S., (1998). Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar anticuerpos anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos obtenidos en la EEA Rafaela. World Health Organization (2005). Laboratory Biosafety Manual. Second Edition. Geneva. World Health Organization (1986). Joint Food And Agriculture Organization Of The United Nations/World Health Organization Expert Committee On Brucellosis. Technical Report Series 740, Sixth Report. Geneva. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 71 �World Organisation for Animal Health (2022). Manual of standards for diagnostic test & vaccines. Brucellosis (infection with Brucella abortus, B. melitensis and B. suis). Wright P.F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev.sci.tech., (12, 435-450). Wright P.F., Tounkara K., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1997). International reference Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech. (3, 824-832). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 72 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de procedimiento. Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0177 Abstract A summary of the resource. El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Técnicas reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Incluye nociones sobre medidas de bioseguridad y controles de calidad a aplicarse en los procedimientos técnicos de laboratorio. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivos Abreviaturas y definiciones Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Principios de bioseguridad Prácticas operativas seguras y hábitos personales Limpieza y desinfección del laboratorio Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Control de calidad de insumos Equipos Sobre la enfermedad Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino Infección por Brucella en ovejas y cabras Infección por Brucella en cerdos Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo Ejecución del ensayo de BPAT Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Desarrollo Ejecución del ensayo Incubación Lectura e interpretación de resultados Informes de resultados Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos Desarrollo Toma de la muestra Ejecución del ensayo Lectura Modificación de la prueba para tanques muy grandes Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Etapas Desarrollo ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero Desarrollo Ejecución del ensayo Lectura e interpretación Fijación de complemento Desarrollo Manejo y conservación de las muestras Condiciones del ensayo Ejecución Lectura de resultados Anexos Bibliografía Brucelosis Laboratorios https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/35eda3021c8fb4a8a2380759c0674b74.pdf 6c70debf728306ca233e15a22a0148d6 PDF Text Text INSTRUCTIVO Renspa: Inscripción y actualización de datos 100% online Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Edición 2025 INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 2 �Índice Introducción 4 Objetivo 4 Aclaraciones 4 Presentación y acceso al sistema Renspa 5 Adhesión de servicios interactivos 5 Delegación de representación de CUIT 8 Solicitud de inscripción al Renspa (Generalidades) 10 Datos de unidad productiva, titular y establecimiento 12 Datos del titular 12 Datos del establecimiento 12 Datos agrícolas 19 Datos ganaderos 22 Finalización del trámite de solicitud de inscripción 23 Recepción del trámite de solicitud en la oficina local 25 Consulta de inscripciones online 25 Otras operaciones 25 Contacto 28 INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 3 �Introducción El Renspa es el Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios que asocia al productor con la producción y el predio donde realiza la actividad. Los productores ganaderos, agrícolas y forestales deben inscribirse en forma obligatoria y gratuita (Resolución Senasa 423/2014). El presente instructivo muestra paso a paso la adhesión de servicios interactivos en la página de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero (ARCA) con clave fiscal. En el ejemplo se muestra la adhesión al Sistema Renspa, pero todos los servicios se adhieren de la misma manera, solo debe seleccionar el correspondiente del listado de servicios interactivos del organismo. Una vez adherido al servicio se describe la inscripción en el Renspa. Objetivo Esta publicación está destinada a usuarios externos con el fin de orientarlos en la inscripción y actualización de sus datos en el mencionado registro de forma completamente digital. Aclaraciones • El Renspa es un registro de productores (responsable sanitario de la producción). Si usted es propietario y arrienda el campo, quien debe inscribirse es solo el arrendatario, es decir, el responsable de la producción. • Se considera establecimiento a la unidad epidemiológica. En un establecimiento puede haber uno o más productores (Renspa). • Unidad productiva: se considera unidad productiva a la unidad que relaciona al productor con la producción dentro de un establecimiento. • Si usted es productor de cereales, oleaginosas y legumbres debe solicitar el Renspa a través del Sistema Integrado de Información Sanitaria Argentino (SISA). • Si usted es propietario y arrienda el campo para cereales, oleaginosas y legumbres no debe solicitar el Renspa bajo ninguna circunstancia ya que este es el registro de productores. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 4 �Presentación y acceso al sistema Renspa Para acceder al Sistema Renspa del Senasa, el usuario debe ingresar utilizando el navegador Mozilla Firefox. 1. Acceder a la web de la ARCA: www.arca.gob.ar. 2. Ingresar con clave fiscal del titular, indicando CUIT y clave. Adhesión de servicios interactivos 1. Cuando ingrese con su clave fiscal, elija al menú ‘Administrador de relaciones de clave fiscal’ como se indica en la imagen inferior. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 5 �2. Una vez dentro del menú, presionar el botón ‘Adherir servicio’. Seleccionar del listado de organismos disponibles ‘Senasa’ Dentro del menú ‘Servicios Interactivos’ buscar y seleccionar ‘Renspa’ INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 6 �3. Una vez seleccionado el servicio, presionar el botón ‘Confirmar’ para finalizar la adhesión. 4. Para confirmar la adhesión, el sistema muestra un formulario con los datos correspondientes. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 7 �5. Después de que se genere este formulario, cerrar la sesión y volver a ingresar con la clave fiscal para actualizar el menú principal, en donde aparecerán los servicios habilitados. Delegación de representación de CUIT La clave fiscal es una contraseña personal e intransferible. Esta clave habilita al usuario para operar servicios desde la página web de la ARCA de manera segura. Es importante tener en cuenta que, para delegar servicios bajo clave fiscal, se debe previamente tramitar la misma con el nivel de seguridad requerido por el servicio. Para delegar la representación de un servicio interactivo a otro CUIT se deben realizar estos pasos dentro del ‘Administrador de relaciones de clave fiscal’, actuando en representación de la CUIT que adhirió al servicio: INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 8 �1. Seleccionar, en esta pantalla, la opción ‘Nueva Relación’. 2. En la siguiente ventana, presionar el botón ‘Buscar’ para elegir el servicio que se delegará. Aquí el sistema permite elegir el servicio, en este caso ‘Renspa’, del mismo modo que en la adhesión. 3. Luego de elegido el servicio, aparece la siguiente pantalla, ahí presionar el botón ‘Buscar’ para elegir al representante. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 9 �4. A continuación, se visualizará esta pantalla que permite completar la CUIT del representante buscado; presionar ‘Buscar’ nuevamente. 5. Por último, confirmar la delegación en esta pantalla presionando el botón ‘Confirmar’. Solicitud de inscripción en el Renspa (generalidades) El usuario con acceso al sistema podrá consultar los registros (Renspa) que se encuentran bajo su titularidad y realizar las siguientes operaciones: • Consulta de oficina local asignada al Renspa • Origen del Renspa • Operación de actualización (reinscripción) • Impresión de documentos (planilla, tarjeta, rótulo) • Operación de baja (por cese de actividad) • Consulta de preinscripciones (trámites con finalización presencial en la oficina local) • Consulta de inscripciones online (trámites 100% online) • Solicitud de nuevas inscripciones al Renspa INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 10 �1. La solicitud de inscripción al registro se realiza mediante el botón ‘Nueva inscripción’ ubicado al pie de la pantalla (como muestra la figura anterior). El sistema mostrará un mensaje explicando el acceso a la operación. 2. Una vez ingresada a la pantalla, deberán completarse los datos solicitados para el trámite de solicitud. El formulario consta de tres solapas: a. Datos de unidad productiva, titular y establecimiento b. Datos agrícolas c. Datos ganaderos A su vez, cada una de las solapas contiene una serie de secciones en las que se debe indicar la información solicitada: Datos de unidad productiva, titular y establecimiento • Datos del titular • Datos del establecimiento Datos agrícolas • Información general • Malezas resistentes • Cultivos agrícolas Datos ganaderos • Explotaciones A continuación, se brinda la información relevante con respecto a cada uno de los datos que se deberán declarar (esta declaración dependerá de si el establecimiento ya se encuentra o no registrado). INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 11 �Datos de unidad productiva, titular y establecimiento Datos del titular En esta sección debe declararse la información del productor responsable de la producción. Como la inscripción se realiza mediante el portal de la ARCA, los campos para los datos de CUIT/CUIL, razón social, provincia, localidad, dirección, DNI (en el caso de persona física), tipo de persona (humana/jurídica), partido/departamento y código postal ya salen completos. Se deberán completar: • N.° de RENAPA: completar solo si se encuentra inscripto como productor apícola en la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca. • N.° de RENAF: se completa automáticamente si el productor se encuentra inscripto como agricultor familiar en la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca. • Correo electrónico: mediante este medio se llevará a cabo la comunicación en la gestión del trámite por parte de la oficina local que lo atienda. • Teléfono de contacto. Datos del establecimiento En esta sección se deben declarar todos los datos del establecimiento sobre el cual se requiere la solicitud de inscripción. Nuevo establecimiento Si se solicita la inscripción de una unidad productiva sobre un establecimiento que no se encuentra registrado, ante la confirmación del trámite el sistema registrará al mismo (con un número de inscripción) y, sobre él, la unidad productiva a nombre de la CUIT ingresada (con una terminación /00 sobre el número de inscripción del establecimiento). Para solicitar la inscripción de la unidad productiva y del establecimiento, se deberán completar los siguientes datos: • Nombre del establecimiento (obligatorio). • Ubicación: provincia, partido y localidad (obligatorios). • Dirección del establecimiento (obligatorio). • Cuartel, lote, fracción y sección (opcional). • Tipo de explotación realizada: agrícola, ganadera o mixta (obligatorio). • Superficie total del establecimiento (obligatorio). • Condición frente a la tierra del productor (obligatorio). INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 12 �• Oficina local para la atención del trámite (se listarán las oficinas que tienen). • Jurisdicción para la atención del trámite (de acuerdo a la ubicación del establecimiento). Dibujo del polígono Cuando se ingresan provincia y partido (como se muestra en la imagen anterior), el mapa realiza un acercamiento para que se pueda visualizar puntualmente la zona en la que se encuentra el establecimiento. Una vez que se muestra el mapa en el partido al que pertenece el establecimiento, se deberá dibujar el polígono que determina su superficie. El área territorial que abarca el establecimiento debe ser delimitada en el mapa, dibujando en él un polígono –de tantos puntos como se requiera marcar– para lograr la mejor aproximación a la forma real del campo. El trámite requiere de esta información para poder continuar. Importante: el polígono es un dato que identifica al establecimiento y no a la unidad productiva por la cual se está realizando el trámite de inscripción. Para realizar el dibujo del polígono que se solicita, seguir los siguientes pasos: 1. Presionar el botón ‘Edición de polígono’ que habilita el mapa para que se pueda dibujar sobre él, o bien reiniciar la operación de dibujo si se necesita volver a empezar. 2. Luego posicionar el cursor sobre el primer punto que se quiera dibujar y hacer clic con el mouse para dejarlo puesto en el mapa. 3. Repetir estos dos pasos para ir posicionando todos los puntos que conforman el dibujo. 4. Para cerrar el polígono, hacer clic sobre el primer punto que se dibujó. Siguiendo los pasos anteriores, el polígono quedará dibujado en el mapa. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 13 �Los puntos que conforman el polígono (que son coordenadas latitud/longitud) quedarán detallados en el componente ‘polígono’ que se encuentra debajo del mismo. Modificación del polígono Si se necesita cambiar el polígono: • se puede arrastrar un punto específico para moverlo de un lugar a otro; • se puede eliminar un punto específico haciendo shift+clic sobre él; • se puede eliminar el polígono para volver a dibujarlo presionando el botón ‘Edición de polígono’ (el sistema solicitará la confirmación del borrado del polígono a través de una alerta). Una vez que se tenga el polígono en el mapa, presionar el botón ‘centrar marcador’ para ubicarlo dentro de este. El marcador es un punto rojo (una coordenada latitud/longitud) cuya posición generalmente se utiliza para indicar la entrada por la cual se tiene acceso al establecimiento. El sistema controlará que el marcador se encuentre dentro del polígono y no permitirá el registro del trámite de otro modo. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 14 �Al centrar el marcador en el mapa (dentro del polígono dibujado), el sistema completará automáticamente la información de latitud/longitud tanto en formato numérico como G.M.S (grados, minutos y segundos). Si usted posee la información latitud/longitud de su establecimiento o los puntos que conforman el polígono, puede realizar el ingreso de esta información de manera inversa: colocando la información en los componentes, el mapa se actualizará y se dibujará de acuerdo a ellos. Una vez finalizado el dibujo, el trazado del polígono mostrará el área total seleccionada (la cual deberá ser aproximada al área que se declarará dentro de los datos del establecimiento). Además, el sistema mostrará los establecimientos vecinos (como se muestra en la imagen siguiente en color azul), tomando como referencia la ubicación del ‘marcador’. Deben evitarse superposiciones en la georreferenciación de las superficies. Una vez finalizada la carga de datos de la unidad productiva, se debe continuar con la solapa agrícola o ganadera [ver: Datos agrícolas y Datos ganaderos]. Establecimiento existente Si la unidad productiva que se inscribirá pertenece a un establecimiento que ya se encuentra registrado en el Senasa deberá ubicar el establecimiento a través de su número de inscripción o a través de una lista de establecimientos a nombre del titular mediante su CUIT. Si se desconoce el establecimiento o la CUIT del titular del establecimiento para ubicarlo, el componente ‘establecimiento existente’ no deberá ser tildado y tendrá que realizar un trámite para un establecimiento nuevo [ver: Nuevo establecimiento]. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 15 �El procedimiento que se deberá seguir es el siguiente: 1. Tildar la opción ‘Establecimiento existente’ que se encuentra en la parte superior de la sección ‘Datos del establecimiento’; esto desplegará un par de opciones para hallar el establecimiento deseado. El sistema proporciona dos opciones para la ubicación del establecimiento, lo cual permite realizar la búsqueda por número de establecimiento o por CUIT del propietario. Búsqueda de establecimiento existente por número de establecimiento Si el usuario conoce cuál es el establecimiento deberá realizar la búsqueda por número asignado: primero, ubicar el número de inscripción en la casilla de búsqueda y, a continuación, presionar el botón ‘Buscar’ (como muestra la imagen siguiente). 1. Al ingresar el número de establecimiento y presionar el botón ‘Buscar’, el sistema realizará la búsqueda del establecimiento, cargando todos los datos del mismo en la sección ‘Datos del establecimiento’. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 16 �2. Como se puede ver en la imagen superior, se cargan automáticamente los datos del propietario del establecimiento y los datos geográficos del establecimiento. Además, el mapa se actualizará mostrando la localización registrada en el organismo. 3. Si necesita realizar una modificación del polígono mostrado, siga los pasos detallados en: Dibujo del polígono. 4. Para terminar de completar la información solicitada en esta solapa, solo restará completar los siguientes datos: • La condición frente a la tierra del productor. • El tipo de explotación (agrícola, ganadera o mixta). • La oficina local que realizará la atención del trámite (se listan las oficinas locales que poseen jurisdicción para la atención del trámite, de acuerdo a la ubicación del establecimiento). 5. Luego, realizar la carga de las solapas ‘Datos Agrícolas y/o Datos ganaderos’ dependiendo del tipo de explotación que realiza [ver: Datos agrícolas y Datos ganaderos]. Búsqueda de establecimiento existente por CUIT del propietario Si el usuario no conoce cuál es el número de establecimiento pero sí posee la CUIT del titular, deberá realizar la búsqueda mediante esta segunda opción. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 17 �1. Utilizando esta opción de búsqueda, se ingresa la CUIT del propietario del establecimiento y se presiona el botón ‘Buscar’. 2. El sistema responderá completando una lista de establecimientos a nombre de la persona, a partir de la cual debe elegirse aquel necesario para la solicitud. Al seleccionarlo, el sistema completará la información del mismo en la sección. Como se puede ver en la imagen anterior, se cargan automáticamente los datos del propietario del establecimiento y los datos geográficos del establecimiento. Además, el mapa se actualizará mostrando la localización registrada en el organismo. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 18 �Si necesita realizar una modificación del polígono mostrado, siga los pasos detallados en: Dibujo del polígono. 3. Para terminar de completar la información solicitada en esta solapa, solo restará completar la siguiente información: • La condición frente a la tierra del productor. • El tipo de explotación (agrícola, ganadera o mixta). • La oficina local a la que se quiera (se listan las oficinas locales que poseen jurisdicción para la atención del trámite, de acuerdo a la ubicación del establecimiento). 4. Luego, realizar la carga de las solapas ‘Datos Agrícolas y/o Datos ganaderos’ dependiendo del tipo de explotación que realiza [ver: Datos agrícolas y Datos ganaderos]. Datos agrícolas La solapa ‘Datos Agrícolas’ posee tres secciones que deberán ser completadas si la explotación de la unidad productiva es agrícola o mixta: Información general A continuación, se presentan los datos de infraestructura y los procesos que se deberán declarar. • Alambrados: cerco perimetral construido con postes y tendido de alambre galvanizado con el objetivo de marcar su límite y cercar el establecimiento o limitar la presencia de animales. • Cortina forestal: barrera vegetal constituida por arbustos o árboles cuyas hojas pueden caerse en época otoñal (caducas) o quedar persistentes a lo largo del año (perennes), su importancia radica en ser una protección contra el viento y limitar posibles contaminaciones y ocurrencias de plagas. • Galpón de maquinarias: sitio que cumple la función de albergar las herra- INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 19 �mientas y maquinarias destinadas para la producción con el objetivo de garantizar su estado y mantenimiento. • Depósito de agroquímicos y biológicos: sitio o lugar físico aislado, separado de la vivienda, y en el cual se depositan de manera correcta todos aquellos productos químicos y biológicos bajo llave o a resguardo (por ejemplo: fertilizantes, insecticidas, herbicidas, etc., los cuales son utilizados en la producción agrícola). • Detalle proceso de poscosecha: solo para productores de frutas u hortalizas, se deberá declarar el acondicionamiento mínimo (por ejemplo: lavado). • Semilla de uso propio: hace referencia a la utilización de la semilla de la campaña anterior en el nuevo ciclo productivo. Malezas resistentes Solo para productores de cereales y oleaginosas, se deberá indicar si en la unidad productiva (UP) existe alguna de las malezas de la lista resistente a herbicidas. Cultivos agrícolas Aquellos cultivos cuyo producto se comercializa en el mercado interno o externo y su destino es el consumo directo, industrial o propagación de especies vegetales, entre otros. 1. Para declarar un cultivo, ingresar el nombre de la especie (puede escribir el nombre común o científico) y presionar la tecla ‘Tab’ o hacer clic con el mouse sobre el fondo de color celeste en la pantalla; esto ocasionará que el sistema realice una búsqueda de productos relacionados, actualizando el combo que se encuentra del lado derecho de la pantalla. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 20 �2. Una vez ubicado el producto que se desea declarar, seleccionarlo y completar el resto de la información pertinente: • Superficie cultivada: Se debe indicar la superficie cultivada para cada especie, expresada en hectáreas (Ha); esta indicación se puede realizar bajo dos modalidades: • Superficie cubierta, significa que se produce utilizando invernaderos o algún otro tipo de cobertura como ser bajo dosel. • Superficie descubierta, el cultivo se realiza a campo abierto sin ningún tipo de cobertura. • Cultivo orgánico: Producto vegetal comercial obtenido bajo condiciones de producción sin el empleo/uso de agroquímicos, entre otras características, para lo cual deberá acreditarse tal situación con la presentación del Certificado de Producción Orgánica, emitido por certificadoras reconocidas ante el Senasa. • Tipos de riego en secano: Se trata de una producción agrícola sin riego (por ejemplo, algunos cultivos extensivos). • Por aspersión: aplicado mediante aspersores. • Por goteo: aplicado mediante el uso de mangueras, caños y el empleo de picos dosificadores dirigidos. • Por manto: aplicado en la modalidad de inundación transitoria. • Por surco: aplicado por manejo de camellones y surcos. • Tipos de destino (no obligatorio): se podrá elegir más de una opción y se podrán seleccionar distintos destinos de la producción: • Consumo animal: para consumo animal de animales. • Exportación: para el mercado externo. • Industria: para industrialización de la producción primaria. • Mercado interno: para la comercialización dentro del país. • Propagación: en caso que el productor realice material de propagación y multiplicación, no semillas. • Uso propio: cuando el productor haga uso, en su establecimiento, de la producción. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 21 �3. Al finalizar, agregar el cultivo con el botón: ‘Agregar cultivo agrícola’. 4. Repetir este procedimiento por cada uno de los cultivos que desee declarar. Leer las resoluciones que se muestren en pantalla y dar conformidad (de corresponder). Datos ganaderos La solapa para la declaración de datos ganaderos consta de dos secciones, que deberán ser completadas si la explotación de la unidad productiva es ganadera o mixta. Explotaciones Para completar esta sección, se deben ingresar las explotaciones ganaderas que se realizarán según especie animal. Allí seleccionar la explotación correspondiente y luego presionar la + verde para agregarla al recuadro ‘Explotaciones seleccionadas’ (como se muestra en la siguiente imagen). INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 22 �Finalización del trámite de solicitud de inscripción 1. Una vez ingresados todos los datos y tildadas todas las declaraciones juradas de las solapas correspondientes, apretar el botón ‘Aceptar’ (ubicado al pie del formulario). De ser necesario, el sistema enviará un correo electrónico para validar la cuenta declarada en la sección ‘Datos de UP, titular y establecimiento’, ya que esta será la vía por la cual se efectuará la comunicación entre el solicitante y la oficina local seleccionada, una vez que se complete el registro. El sistema informará sobre esta inscripción mostrando en pantalla lo siguiente: Se deberá tener al alcance el número de trámite, correo electrónico y CUIT registrados ante cualquier eventualidad. Estos datos servirán para la identificación unívoca del trámite realizado. 2. Para terminar con el proceso de registro del trámite, acceder a la cuenta de correo electrónico declarado y seleccionar aquel mensaje con la siguiente información: • Remitente: “Sistema Renspa” <sistema_renspa@senasa.gob.ar> • Asunto: “Inscripción online al Renspa” En ese correo electrónico se encontrará información resumida de la solicitud junto con un enlace al pie que deberá ser utilizado para finalizar el proceso de inscripción. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 23 �Revisar la casilla de spam si no encuentra el correo electrónico enviado en su bandeja de entrada. Una vez completado el proceso de solicitud de inscripción, puede realizar el seguimiento de su trámite desde la pantalla accesible a través del enlace: ‘Consulta de inscripciones online’, disponible en la pantalla principal. Desde esta pantalla, puede conocer el estado actual de la petición. Recepción del trámite de solicitud en la oficina local La oficina local del Senasa asignada al trámite evaluará los datos declarados para confirmar o rechazar la solicitud. Durante la atención del trámite, si el agente así lo requiere puede comunicarse por correo electrónico para solicitar información requerida en la atención de la solicitud. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 24 �La resolución del trámite (ya sea una confirmación o un rechazo) será remitida al correo electrónico confirmado y se comunicará a la oficina local asignada ante cualquier eventualidad. La credencial de inscripción puede ser impresa desde la pantalla principal una vez recibida la notificación de confirmación al registro [ver: Impresión de documentos]. Consulta de inscripciones online El usuario podrá consultar el listado de inscripciones online realizadas y su estado. Este tipo de modalidad es 100% online, sin necesidad de finalización presencial en la oficina local. Accediendo a esta pantalla, podrá realizar un seguimiento de sus inscripciones online. Otras operaciones Oficina local del Renspa 1. Para conocer la oficina local asociada al Renspa, posicione el cursor del mouse sobre el ícono: 2. Si necesita ponerse en contacto con la oficina local por su trámite, puede ubicarla a través de la información publicada en el siguiente enlace. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 25 �Actualización de datos (reinscripción) Todos los productores agrícolas deben realizar una actualización de datos al menos una vez al año o cuando cambie de cultivo o actividad. 1. La actualización se realiza ingresando a través de la página de la ARCA, realizando el login con CUIT y clave fiscal y adhiriendo al servicio de Renspa. 2. Una vez en el sistema, ubicar el registro de interés de la lista de aquellos que se visualizan y presionar el botón ‘Reinscribir’. 3. Mediante esta opción, el sistema redirigirá al formulario de actualización. Se deberá realizar la actualización de datos anual si se trata de un productor agrícola y forestal, mixto o productor ganadero en zonas de no vacunación antiaftosa. La credencial actualizada puede ser impresa desde la pantalla principal una vez realizada la reinscripción en el registro [ver: Impresión de documentos]. Es obligatorio que todos los productores mixtos y ganaderos de las zonas de no vacunación antiaftosa actualicen sus datos anualmente. Impresión de documentos Desde la pantalla principal, pueden imprimirse los siguientes documentos: • Planilla de inscripción • Credencial • Rótulo INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 26 �Baja (por cese de actividades) La baja (únicamente por cese de actividades) podrá realizarse accediendo desde la pantalla principal, presionando el botón ‘Baja’ sobre el registro deseado. De este modo, se accederá a una pantalla para realizar la baja de la unidad productiva. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 27 �Reactivación de un registro dado de baja Si el usuario posee un registro (Renspa) dado de baja por cese de actividades y necesita que vuelva a estar activo, simplemente deberá llevar a cabo una operación de reinscripción sobre el Renspa [ver: Actualización de datos (reinscripción)]. Si el registro está dado de baja por un motivo diferente a ‘cese de actividades’, el usuario deberá comunicarse con la oficina local asociada al mismo [ver: Oficina local del Renspa]. Contacto Ante dudas o consultas, no dude en utilizar el bot disponible al pie en la pantalla principal del sistema (a la derecha) para comunicarse con la mesa de ayuda. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 28 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Renspa: Inscripción y actualización de datos. 100 % online. Instructivo Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Relation A related resource Resolución SENASA N° 423/2014 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0176 Abstract A summary of the resource. Esta publicación está destinada a usuarios externos con el fin de orientarlos en la inscripción y actualización de sus datos en el Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (Renspa), de forma completamente digital. Se detalla el paso a paso para realizar la adhesión de servicios interactivos en la página de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero (ARCA) con clave fiscal. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivo Aclaraciones Presentación y acceso al sistema Renspa Adhesión de servicios interactivos Delegación de representación de CUIT Solicitud de inscripción al Renspa (Generalidades) Datos de unidad productiva, titular y establecimiento Datos del titular Datos del establecimiento Datos agrícolas Datos ganaderos Finalización del trámite de solicitud de inscripción Recepción del trámite de solicitud en la oficina local Consulta de inscripciones online Otras operaciones Contacto https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/c67e321db4a4af3ffda74dc58bd5e2ed.pdf 05a674584415fb64387c5c4b00dcf3ac PDF Text Text Guía para el manejo responsable de residuos por el uso de productos garrapaticidas Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2024 �Introducción Esta guía tiene como objetivo establecer los procedimientos generales que se deben seguir para el manejo responsable de residuos provenientes de productos veterinarios garrapaticidas (PVG). Es importante tener en cuenta que todas las indicaciones para el uso y posterior descarte se encuentran detalladas en el prospecto, según el producto utilizado. Por lo general, se debe evitar o minimizar la generación de residuos por el uso de PVG. La eliminación de los productos, soluciones, emulsiones y cualquier subproducto debe cumplir en todo momento con los requisitos de la legislación de protección ambiental y disposición de residuos, en acuerdo con las normativas locales, nacionales e internacionales. I. Procedimiento para el desecho de envases de PVG a. Eliminar los productos sobrantes no reciclables –como frascos, bidones y bolsas– a través de un contratista de eliminación de residuos fehacientemente autorizado en la región. b. Los envases de desecho deben reciclarse toda vez que sea posible y solo puede considerarse el enterramiento o la incineración cuando el reciclaje no sea viable. Esta práctica se podrá realizar en un lugar seleccionado para tal fin. c. Previo a la eliminación de envases de PVG de uso en forma de inmersión/ aspersión, se debe realizar el lavado aplicando la técnica internacional del triple lavado, la cual consiste en llenar una cuarta parte del envase vacío con agua, tapar y agitar en forma enérgica por un minuto, vaciando el contenido en el bañadero, repitiendo esta acción en dos ocasiones más. d. Evitar que los residuos de limpieza o enjuague lleguen a un curso de agua o cualquier forma de desagüe. e. Cuidar la manipulación de recipientes vacíos que no hayan sido limpiados o enjuagados, ya que podrían estar presuntamente vacíos. f. Seguir las recomendaciones de uso que indica el producto y tener precauciones con respecto al almacenamiento, cuidados durante la aplicación, derrames accidentales, entre otros. g. Prestar especial atención a las indicaciones del laboratorio –en cajas, prospectos y marbetes– con respecto a las precauciones generales y recomendaciones en caso de incendios, derrames, contraindicaciones y limitaciones de uso, observando los PICTOGRAMAS de seguridad aclaratorios. GUÍA PARA EL MANEJO RESPONSABLE DE RESIDUOS POR EL USO DE PRODUCTOS GARRAPATICIDAS 3 �Manejo adecuado y cuidado del medio ambiente Nuevos pictogramas Técnica del triple lavado Hágalo 3 veces Agrege agua hasta 1/4 de la capacidad del envase Cierre el envase y agite durante 30 segundos Vierta el agua del envase en el equipo pulverizador Perfore el envase para evitar su reutilización II. Procedimiento de inactivación de residuos químicos en bañaderos de inmersión y de aspersión a. Los residuos químicos de los bañaderos, tanto de inmersión como de aspersión, no deben eliminarse en ningún tipo de desagüe, curso o corriente de agua, ni en cercanías de las mismas sin ser tratados. b. En los PVG con base en las amidinas (amitraz) se debe acidificar el medio inactivando el mismo a través del agregado de ácido muriático comercial en proporción de 500 ml por cada 1.000 litros de líquido en el baño de inmersión o pileta de recupero del baño de aspersión y agitar en forma vigorosa. c. En los PVG con base en piretrinas sintéticas o piretroides y las mezclas piretrinas-organofosforados se debe alcalinizar el medio inactivando el mismo con el agregado de una solución de hipoclorito de sodio en proporción de 10 litros por cada 1.000 litros de líquido o 10 kilos de hidróxido de calcio por cada 1.000 litros de agua, en el baño de inmersión o pileta de recupero del baño de aspersión y agitar en forma vigorosa. GUÍA PARA EL MANEJO RESPONSABLE DE RESIDUOS POR EL USO DE PRODUCTOS GARRAPATICIDAS 4 �d. Los métodos descriptos se encuentran recomendados por el laboratorio elaborador y aprobado por el organismo regulador correspondiente. Además, se lo puede encontrar en el marbete del producto. III. Verificación de la inactivación Para constatar la inactivación de la emulsión, se deberá realizar el análisis de la concentración del principio activo correspondiente del líquido de balneación o aspersión. Para lo descripto en el inciso b. del apartado II) puede estimarse un tiempo de inactivación entre dos (2) y cinco (5) días; para lo descripto en el inciso c. del apartado II) el tiempo estimado es de diez (10) a quince (15) días. Contacto Programa de Garrapata del Bovino Correo electrónico: garrapatas@senasa.gob.ar Teléfono: (11) 3144-1973 GUÍA PARA EL MANEJO RESPONSABLE DE RESIDUOS POR EL USO DE PRODUCTOS GARRAPATICIDAS 5 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Guía para el manejo responsable de residuos por el uso de productos garrapaticidas Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0175 Abstract A summary of the resource. Esta guía tiene como objetivo establecer los procedimientos generales que se deben seguir para el manejo responsable de residuos provenientes de productos veterinarios garrapaticidas (PVG). Por lo general, se debe evitar o minimizar la generación de residuos por el uso de PVG. La eliminación de los productos, soluciones, emulsiones y cualquier subproducto debe cumplir en todo momento con los requisitos de la legisla�ción de protección ambiental y disposición de residuos, en acuerdo con las normativas locales, nacionales e internacionales. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción I.Procedimiento para el desecho de envases de PVG II. Procedimiento de inactivación de residuos químicos en bañaderos de inmersión y de aspersión III. Verificación de la inactivación Contacto Garrapatas https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/56541f1b5f1e36dc29eef0c7679b1b5f.pdf fac203e52e86bb4237914f4bb4703e42 PDF Text Text MANUAL DE PROCEDIMIENTO Uso correcto de bañaderos y productos veterinarios garrapaticidas Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 4 Objetivo 4 Bañaderos: de inmersión y de aspersión 4 Emplazamiento común 4 Estructura básica común a ambos bañaderos 5 Infraestructura de bañaderos de inmersión 5 Especificaciones 5 Cubicación 7 Elementos 8 Manejo 9 Infraestructura de bañaderos de aspersión Principales características 13 13 Especificaciones 14 Limpieza de tropas para despacho y protocolos 16 Protocolo con baño de inmersión 16 Protocolo con productos pour on o inyectables 17 Uso de productos veterinarios garrapaticidas distintos de balneación 18 Uso racional de los PVG 18 Planificación de los tratamientos 19 Contacto 21 �Introducción La garrapata común del bovino es un parásito que posee un ciclo biológico caracterizado por una etapa ambiental y otra parasitaria (sobre el animal). Esta parasitosis se encuentra complejizada porque, en su etapa ambiental, los tiempos de sobrevida son muy variables, sumado a que la garrapata posee una resistencia innata a las moléculas (incluso a las que todavía no ha sido expuesta), con una gran capacidad reproductiva de las teleoginas (hembra adulta) y la posibilidad de ser potenciales vectores de enfermedades asociadas, como la tristeza bovina. Objetivo El presente manual está destinado a productores, veterinarios y profesionales del ámbito rural. Esta publicación tiene como propósito informar sobre tratamientos garrapaticidas prolijos y eficientes, para lograr que el producto aplicado exprese su máximo potencial de efecto ixodicida sobre la población de garrapatas presente en el animal, minimizando así los tiempos de aparición de la resistencia a las diferentes moléculas. Bañaderos: de inmersión y de aspersión Emplazamiento común Las instalaciones del bañadero deben contemplar las interacciones con el ambiente y estar ubicadas –preferentemente– en un sitio que sea central (respecto a los potreros del establecimiento), sobre un terreno elevado, para asegurar el drenaje y facilitar el desagote del baño (evitando la contaminación de cursos naturales de agua). Además, se debe contar con una buena disponibilidad de agua y acceso permanente a los caminos firmes del establecimiento. Estructura básica común a ambos bañaderos a. Corrales de encierre: deben tener una capacidad variable, de acuerdo al tamaño del rodeo involucrado. b. Manga de entrada al baño: es recomendable que cuente con un piso rugoso para favorecer la limpieza de las pezuñas, previo al ingreso del bañadero; preferentemente, construir un lavapatas. c. Escurridero: es una plataforma de drenaje donde se depositan los animales posteriormente al nado con el objetivo de que estos escurran todo el excedente líquido. Mide aproximadamente 4 x 5 metros y está conectado directamente a la salida del baño. Específicamente se recomienda: • Un escurridero dividido en dos partes, con una puerta que controle alternativamente el ingreso hacia las dos secciones (derecha e izquierda). USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 4 � • Un piso de concreto con peldaños en sus orillas y un desnivel adecuado para drenar el excedente hacia la pileta de decantación. • Que el bañadero se encuentre techado. De lo contrario, se debe prever una salida del agua de lluvia hacia el exterior. Cuando no se utilice el baño, esta salida debe permanecer abierta. Infraestructura de bañaderos de inmersión Especificaciones En la pileta, la pared frontal no debe tener un ángulo recto con el piso, por lo tanto, se sugiere una concavidad amplia, a fin de evitar que se deposite mucho sedimento. Por su parte, las paredes laterales –tanto en el ingreso como en el egreso del bañadero (sección de la rampa de despegue y hasta el final de la rampa de salida)– deberán ser rectas y tener 0,30 m de espesor y 1,75 m de alto desde el nivel del suelo. En la entrada del bañadero, las paredes laterales deben continuar por al menos 2 metros; en su salida, se recomienda que continúen por al menos 3 metros más, para que los animales no puedan ver hacia afuera. En la parte media, deben tener, al menos, entre 40 y 50 cm sobre el nivel del líquido; estas paredes pueden contar con un reborde cóncavo superior interno (a 40 USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 5 �cm del nivel de trabajo del líquido) para desviar y hacer rebotar hacia la pileta del bañadero el líquido que se levanta por las paredes. El largo deberá permitir un tiempo de nado correcto del animal; es decir, midiendo la pileta y estando al nivel de la superficie del líquido, no debería ser menor a 11/12 metros, llegando a unos 13/14 metros totales hasta el final de la escalera de salida. A nivel de la parte inferior, no menor a 7 metros. Preferentemente, el piso debe tener un declive leve (1 cm por cada metro de longitud total) hacia la escalera de salida, a los fines de facilitar el vaciado del líquido en momentos de limpieza y recambio del producto. Respecto a la profundidad del baño, la misma debe tener un nivel no menor a 2 metros, de forma tal que asegure la completa inmersión del animal. En cuanto al ancho del baño, en el nivel del agua debe ser entre 0,85 y 1,05 m; mientras que hacia el fondo debe disminuir a 0,45 - 0,60 m. La rampa de despegue es una plataforma desde la cual saltan los animales al baño. La misma debe contar con un largo de 1,2 a 1,5 m. y 0,85 m. de ancho, con desnivel hacia el baño y una superficie sutilmente áspera, para proporcionar el apoyo adecuado del bovino. El borde de la rampa estará convenientemente proyectado en forma de un labio redondeado hacia el tanque, con el objetivo de hacer rebotar las olas hacia adentro de la pileta principal. Para un apoyo más seguro, la salida de la rampa debe contar con gradas bajas, de 0,15 m de alto y 0,40 m de profundidad. La estructura del bañadero también debe precisar de dos piletas de decantación que, por su diseño y disposición, detienen las partículas más gruesas del retorno del líquido de baño. Es necesario corroborar la altura de los caños de ingreso y egreso de los líquidos, tapones, etc. Las dos piletas decantadoras (con medidas de 40 cm x 40 cm x 80 cm), que se ubican entre el escurridero y el bañadero conectando ambas secciones, permiten el retorno del líquido de los animales tratados con la menor cantidad posible de material orgánico. El techo –o algún tipo de cobertura– es obligatorio para el bañadero. Debe abarcar incluso el escurridero y la rampa de despegue para disminuir la evaporación y evitar el ingreso de agua de lluvia a la pileta principal. Cabe USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 6 �destacar que la altura del techo es clave para la actividad del baño, ya que el largo de los mangos de las horquillas y agitadores puede verse dificultado si se encuentra a menos de 4 m. Usualmente, el techo se construye con chapa galvanizada y a dos aguas. La pileta de cubicación debe tener al menos una capacidad de 1000 (un mil) litros, con medidas de 1m x 1m x 1m. La misma tiene que estar conectada con el baño cerca de su entrada, a través de un caño grueso de aproximadamente 4 pulgadas y con una llave de corte de paso de agua; en la pared de la pileta de cubicación deberán indicarse los volúmenes correspondientes a 500 y 1000 litros. Para realizar un óptimo mantenimiento edilicio, las estructuras de todo el bañadero deben mantenerse en buenas condiciones –arreglando y evitando fisuras en la construcción– sobre todo por debajo de la línea de agua del nivel de trabajo, que permitan el drenaje continuo del principio activo. Cubicación La cubicación de un bañadero es fundamental para determinar el volumen de agua necesario para el tratamiento y es un requisito para su habilitación. El baño estará oficialmente habilitado cuando la cubicación sea realizada por personal del Senasa o por los entes sanitarios que se encuentren capacitados. Sin una correcta cubicación del bañadero no podrá hacerse una eficaz aplicación del tratamiento. Una diferencia de 20 litros puede ocasionar cambios en la concentración del producto. La cubicación debe realizarse con una probeta, elemento de laboratorio calibrado de 1 o 5 litros. Con este instrumento se calibrará un volumen máximo de 20 litros en un balde de plástico, que luego permitirá cargar la pileta de cubicar y finalmente la pileta principal del baño. El balde deberá estar perforado y tener ranuras al llegar a los 20 litros de carga. Esto permitirá que el líquido que se requiera medir en el balde, nunca supere el volumen calibrado. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 7 �La primera línea de cubicación de la regla debe marcarse –usualmente– a partir de los 5000 litros. Luego, las marcas se aplicarán cada 1000 litros hasta llegar a 8000 o 9000. A partir de este volumen, las marcas se realizarán cada 500 litros, hasta llegar al nivel de uso del baño, con la profundidad adecuada. Luego, siguiendo el mismo procedimiento, marcarán en la regla 2000 litros más de agua, que luego serán desechados. Esto se realiza para poder conocer y prever el volumen de agua ingresado por lluvias. Al confeccionar la regla, se debe tener la precaución de tomar las medidas (con una cinta métrica) de cada una de las marcas de la cubicación y registrarlas en una planilla, preferentemente un registro en papel. También se recomienda confeccionar una regla más de repuesto, para que en el caso de rotura o pérdida, esta pueda ser reemplazada. Elementos La regla es un elemento clave y muy importante del bañadero, ya que de su correcta calibración y uso depende –entre otras cosas– el buen funcionamiento del bañadero. Con la regla se lleva a cabo una correcta reposición y refuerzo del principio activo y, por lo tanto, el mantenimiento adecuado de su concentración. Para su construcción se puede utilizar madera, pero debe recordarse poner una chapa en la base (pie) para evitar el desgaste u opcionalmente una regla con forma de T, que llegue hasta unos 20 cm del piso del bañadero. Debe estar correctamente marcada, conforme la cubicación practicada en la pileta principal. Al confeccionar la regla, se debe tener precaución al momento de tomar las medidas de cada una de las marcas de la cubicación y USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 8 �registrarlas en una planilla. Esto permitirá, en caso de rotura o pérdida, que la misma pueda ser reemplazada. El agitador o removedor es la herramienta clave para mezclar y homogeneizar la preparación del líquido garrapaticida; debe tener un mango lo suficientemente largo –aproximadamente 2,50 m–, para garantizar que el operario llegue a los extremos inferiores de la pileta donde se produce la mayor concentración de sedimentos que secuestran partículas del producto. Las horquillas son otro elemento necesario y fundamental al momento de usar el bañadero, ya que permitirá sumergir al menos 2 veces la cabeza del animal durante el baño. Manejo La preparación de la formulación inicial se debe realizar según las indicaciones, cumpliendo con los volúmenes de agua calibrados. Un baño que no esté cubicado tendrá problemas en el manejo de los volúmenes de agua y consecuentemente en la concentración del principio activo. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 9 �a. Pie de baño: es la carga inicial de un producto veterinario garrapaticida (PVG), es decir, la cantidad de producto incorporado en el agua al preparar un baño. Generalmente, se expresa como litros de producto por cada 1000 litros de agua. b. Reposición y refuerzo del principio activo. Se deberá realizar cada 1000 litros como máximo. Cuando el nivel de nado o trabajo sea inferior a este volumen, deberá hacerse la reposición de agua y refuerzo del PVG. Se recomienda siempre seguir las indicaciones del laboratorio. c. Es fundamental entender la importancia de la medición del pH del líquido garrapaticida. Para ello, se utilizan tiras reactivas comerciales o un peachímetro digital. Los productos a base de amitraz trabajan en medio alcalino (pH 12-14), razón por la cual su estabilizante es la cal (hidróxido de calcio). Si el pH alcanza o baja de 10, el amitraz se desnaturalizará rápidamente. Los piretroides, fosforados o combinaciones funcionan a pH neutro o ligeramente ácido (6.4-6.8, 7) y no requieren condiciones de manejo de pH, ya que naturalmente las soluciones tienden a acidificarse debido a su contaminación con materia orgánica (pelos, materia fecal y tierra). d. El análisis de concentración del principio activo se debe realizar previo a la utilización de un nuevo baño, cuando hayan pasado una cantidad considerable de animales que haga suponer problemas en la concentración del líquido garrapaticida, o luego de un tiempo de inactividad del bañadero. Esto último se debe a que los tiempos de inactividad del bañadero determinan la acción de descomposición de los principios activos, tanto por acción microbiana como por el cambio del pH de la preparación. Por ello, es clave realizar este análisis antes de reiniciar su uso. Lo correcto es realizar cada 90 a 180 días, establecido según criterio técnico. El líquido garrapaticida del bañadero se encuentra expuesto a factores ambientales externos, que modifican o perjudican la estabilidad de los principios activos y su acción ixodicida. DESGASTE DEL BAÑADERO Suciedad Acidez Arrastre Factores principales en la concentración del p.a. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 10 �Esta muestra del líquido del baño debe ser tomada por personal capacitado inmediatamente finalizada la balneación de los animales. La extracción de la misma se realiza mediante la introducción de una botella descartable, que puede estar atada a la regla del baño; esta última se sumerge en la parte media del bañadero –a una altura equidistante entre el piso y la superficie– y se llena ¾ del envase con el líquido. Para finalizar el proceso de remisión de la muestra, se debe adjuntar el protocolo completo y enviarla a un laboratorio habilitado e inscripto en la Red Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab). El líquido será analizado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), a los fines de obtener el dato preciso de la concentración del principio activo del bañadero al momento de la toma de muestra. Además, nos brinda información del pH y el porcentaje de sedimentos presentes, lo que permite luego realizar las correcciones adecuadas, según indicación del laboratorio o del profesional interviniente. e. Factores para tener en cuenta en el momento de la balneación • Balneaciones: previo a realizar los baños, agitar correctamente con el removedor y durante 10 minutos el líquido garrapaticida para obtener una correcta homogeneización del producto en todo el bañadero. Luego, se deberá realizar el pasaje de los animales antes de iniciar la rutina de su baño en los corrales. • Mojar todo el cuerpo del animal durante 15 segundos y sumergir al menos 2 veces la cabeza de cada animal, utilizando las horquillas. • Llevar un ritmo de baño constante, sin apuros y logrando que ningún animal quede sin ser tratado. • Recuperación del líquido de baño del escurridero. Una vez escurridos los animales (en un periodo acorde), verificar que se produzca una buena recuperación del líquido, con un declive correcto para el retorno del mismo. Se debe tener en cuenta no dejar un tiempo excesivo, ya que los animales defecan y orinan, lo cual afecta la calidad y composición del líquido recuperado. • Reposición y refuerzo. Luego del pasaje de determinada cantidad de animales y una vez que se han consumido 1000 litros del líquido de baño (o el 10% del volumen de trabajo), el bañadero debe volver a sus niveles iniciales mediante el agregado de agua y la cantidad necesaria del producto para recuperar la concentración del principio activo. • No mezclar distintos PVG aunque la molécula sea la misma ya que, de acuerdo a la marca comercial, la formulación será diferente (excepto extensión de marca). • En los bañaderos cargados con PVG elaborados con amitraz no se deben agregar otras sustancias diferentes del estabilizante específico. El producto requiere de un medio alcalino (pH 12 – 14). • En los bañaderos cargados con PVG elaborados con piretroides y/o mezclas piretroides y fosforados no se deben agregar sus- USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 11 �tancias acidificantes sin haber consultado previamente al laboratorio elaborador. El producto requiere de un medio ácido a neutro (pH 6.4-6.8 a 7). f. Planillas de registro: durante el uso del bañadero es fundamental llevar actualizadas las planillas de cubicación y de pasaje para registrar, de forma ordenada, el nivel del bañadero al inicio y finalización cada jornada de baño. Se deberá registrar la fecha, reposiciones y refuerzos, cantidades, litros de agua agregados, número de animales bañados y todo dato que favorezca a un efectivo control de manejo. Errores frecuentes cometidos en los baños • Instalaciones deficientes y personal insuficiente. • Baños parciales del lote (un solo animal sin bañar ya es un baño parcial). • Falta de control y supervisión del encargado (bañar animales sedientos o cansados). • Mala cubicación del baño. • Preparación incorrecta del pie de baño. • Tiempo de nado corto, sin respetar los tiempos mínimos (15 segundos por animal). • Incorrecta sumersión de la cabeza. • Poca profundidad del baño. • El uso del baño hasta descenso del nivel óptimo (más del 10%) complica la reposición. • Incorrectas reposiciones y refuerzos del producto activo. • Uso del baño vencido, por tiempo o número de animales bañados. • No identificar los animales bañados, mezclando tratados con no tratados. • Intervalo incorrecto entre baños. • Mezclar principios activos o productos comerciales (aunque sean de la misma familia química). • Bañar en días de lluvia o pronóstico de la misma. • Bañar a “manga abierta”, con apertura de las puertas de salida del escurridero. • Trabajar con corrales muy embarrados. • No dejar escurrir bien los animales luego del baño. • Arrear los animales recién bañados a un potrero con agua o que USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 12 �tengan agua en el trayecto. • No realizar los análisis periódicos del contenido recomendado. • No asegurar el cierre del retorno de agua del escurridero. • No llevar los registros del baño (pasaje, refuerzo, reposiciones). • No registrar el nivel al inicio, durante y después de cada baño (si se agrega agua o producto). • No agitar bien el contenido antes del inicio del baño. Infraestructura de bañaderos de aspersión Principales características El bañadero de aspersión o “manga de aspersión” para uso en rodeos o lotes chicos funciona como un túnel cerrado, en donde el techo, los laterales y –en algunos casos– el piso o los laterales inferiores operan como soporte para la instalación de las mangueras que cubrirán dichas superficies del túnel. En este último, se dispersará el líquido a presión, a través de picos de aspersión o perforaciones bien logradas, de modo tal que cuando se produce el pasaje de los animales por la manga, estos resulten mojados completamente. Factores para tener en cuenta en el uso del bañadero de aspersión • Método de aplicación amigable en cuanto al bienestar animal. Su manejo es más práctico, ya que no requiere de mucho personal. • Cuando la aplicación del producto exija dilución previa, se deben respetar los volúmenes recomendados y las indicaciones del laboratorio. • La pulverización de los animales no deberá ser realizada durante las horas más calurosas del día y deberá realizarse preferentemente a favor del viento (nunca en contra por peligro de intoxicación) y, en lo posible, a contra pelo. • Evitar pulverizar animales cansados, sedientos o debilitados. • El final del túnel debe terminar sin luz (escurridero techado) o con luz tenue. • Se estima que un bovino adulto necesita un mínimo de cinco (5) litros de preparación para mojar el animal entero. El volumen exacto dependerá del tamaño y la raza del animal en cuestión (se calcula aproximadamente en el 1% del peso vivo). • No requiere mayor preparación previa, –como medir o completar nivel, refuerzo y reposición, pH–. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 13 � • Mejor aprovechamiento del agua, ya que solo se prepara un volumen de líquido específico para la cantidad de animales que se bañarán. • Menor contaminación ambiental. • No requiere monitoreo. • Se utiliza producto en concentración de pie de baño. Así, mantiene su estabilidad asegurando la eficacia. • No hay posibilidad de degradación o metabolización (bacterias, hongos) que altere su estructura y su eficacia. • Prolonga la vida útil de los productos. • Permite la fácil rotación de los principios activos, ya que en cada ronda de baño se puede utilizar un producto garrapaticida distinto. • Se recomienda trabajar sin recupero para su reutilización. Solamente se realiza el recupero para proceder a la inactivación del garrapaticida, previo a su descarte. • La velocidad de pasaje de los animales debe ser regulada mediante el uso de un sistema de peine y banderas a la salida o cortina de nylon. • En caso de que los animales no resulten totalmente mojados, se puede repetir la ronda de pasaje. Especificaciones El bañadero debe tener una estructura similar a una manga (de madera o aluminio), con la condición de que sea diseñado como un túnel cerrado, considerando las siguientes especificaciones: a. Medidas de la manga (largo/ancho/alto): 6/1.22/2 metros. b. Piso: preferentemente de hormigón, aunque existen también de madera y acero inoxidable. c. Paredes: conservarán las mismas medidas que la manga, continuando en un túnel cerrado y cubiertas de chapa galvanizada u otro material impermeable. d. Presión de la bomba: mínimo 2 pulgadas y 10 HP. e. Picos de aspersión: muchas veces dependerán del largo de la manga, variando en la cantidad; pero deben ser distribuidos de manera uniforme, tanto en los laterales como arriba y abajo, de manera tal de que sean suficientes como para verificar el total mojado del animal. f. Dirección de los picos: no debe estar enfrentada sino en dirección oblicua/diagonal, mirando hacia adentro de la manga. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 14 �g. Escurridero: mismos requisitos descriptos para el bañadero de inmersión. h. Pileta o cisterna de preparación del líquido garrapaticida: mínimo mil (1000) litros. i. Cisterna de recupero: deberá ser del mismo volumen que la cisterna de preparación. Prestar especial atención a las indicaciones de uso del laboratorio, ya que las concentraciones para la preparación del producto podrían variar con respecto al uso por inmersión. Se recomienda no desarrollar o utilizar estructuras muy caseras, ya que se incurriría en el mismo efecto que al usar una mochila de aspersión. Una de las principales debilidades del método de aplicación por aspersión radica en su capacidad limitada para mojar completamente al animal o en la insuficiente impregnación de áreas específicas del cuerpo, como puede ser la región inguinal, las ubres y el interior de las orejas. Esta debilidad se minimiza con: • un mayor largo de la manga de aspersión, ya que existe una correlación entre el largo y la cantidad de picos; • sistema de tuberías y boquillas suficientes (arriba, laterales, abajo); • buena presión constante de agua, a través de una bomba; • debe contar con tanque para la preparación de la formulación, suministro de energía o motor generador para la bomba; • que sea una manga cubierta (túnel); • asegurar el correcto mojado (para ello se pueden realizar dos pasadas de los animales por la manga). USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 15 �Una buena aspersión debe generar una nube que dificulte la visión de un lado al otro de la manga. Limpieza de tropas para despacho y protocolos Antes de realizar los tratamientos, es fundamental tener en cuenta que: • Todos los animales deben estar identificados con caravanas oficiales, registradas ante el Senasa. • Antes de elegir PVG aprobados por el Senasa, es necesario asesorarse con un veterinario privado. • Los tratamientos funcionarán siempre y cuando la población de garrapatas que estemos tratando sea susceptible al principio activo. • Verificar la disponibilidad de un bañadero con análisis actualizado en el establecimiento. Protocolo con baño de inmersión La limpieza de tropas con baños de inmersión debe realizarse de la siguiente manera: • Aplicar dos (2) baños, con un intervalo de nueve (9) días. • Revisar al animal cinco (5) días después del último baño. • Si el animal resulta limpio se podrá despachar. • Previo al carguío de la tropa, realizar el tratamiento precaucional. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 16 �Protocolo con productos pour on o inyectables La aplicación de PVG autorizados por el Senasa, distintos a los de inmersión, son una opción válida cuando no se cuenta con un bañadero de inmersión o aspersión o cuando detectamos resistencia de la garrapata a las drogas de contacto (amitraz, cipermetrina, etc.) Para pour on, utilizar formulaciones que contengan fluralaner, fipronil o piretroides como principio activo. Existen también otros productos combinados con fipronil + avermectinas (ivermectina o abamectina). Para la aplicación de inyectables existen productos monodroga, es decir, formulaciones que contienen un solo principio activo. Por ejemplo, dentro de la familia de las avermectinas se encuentran varios productos que contienen ivermectinas en diferentes concentraciones, algunos otros con doramectina. En general, los PVG de tipo inyectable no son los más aptos para lograr una correcta limpieza de los animales. Si elegimos estos productos, se recomienda –previo a su aplicación– asesorarse sobre la capacidad de volteo que poseen. La aplicación conjunta de inyectables y pour on puede eventualmente ser también una opción, siempre que no se traten de los mismos principios activos o sean moléculas con el mismo mecanismo de acción. En conclusión, los tratamientos para despacho de animales con destino distinto a la faena deben realizarse con suficiente anticipación y funcionarán según lo esperado, en relación a la sensibilidad de la población de garrapatas del campo a uno o varios principios activos utilizados. Así, los productos más eficaces suelen ser los utilizados en forma de balneación, al actuar en forma de contacto directo. El resto de los PVG (pour on o inyectables) actúan por ingestión (cuando la garrapata se alimenta) y es necesario un cierto tiempo para conseguir la letalidad adecuada. También, deben considerarse los tiempos de espera para realizar las revisaciones que demuestren el resultado obtenido. De acuerdo a la variedad de PVG aprobados para su uso, se pueden establecer los siguientes plazos de revisión: - Amidinas (amitraz), piretroides o mezclas piretroides-fosforados deben revisarse 5 días después del segundo baño. - Lactonas macrociclicas (avermectinas) y fipronil como monodroga (o en mezclas comerciales) deben revisarse entre los 7 a 10 días posteriores a la aplicación, según su poder de volteo. - Fluralaner tiene un período de espera para inspección de 10 días. El fluazurón no se considera un producto apto para su utilización en procedimientos de limpieza. Se recomienda organizar las tareas con anticipación al despacho, teniendo en cuenta que cuando se aplica un tratamiento garrapaticida se debe esperar un tiempo prudente para que el producto actúe. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 17 �Los tiempos de espera para la inspección del animal deben respetarse o se estará haciendo una lectura errónea del efecto ixodicida. Uso de productos veterinarios garrapaticidas distintos de balneación Los factores que se deberán tener en cuenta cuando se aplican productos pour on (derrame dorsal) e inyectables son los siguientes: • Utilizar solo PVG aprobados por el Senasa. • Respetar estrictamente las recomendaciones de uso del laboratorio elaborador. • Realizar el pesaje de la totalidad del lote de los animales para tratar (en caso de que sean pocos). • Tratar la totalidad del lote o potrero. • Trabajar a manga cerrada y de forma pausada para una correcta aplicación. • Evitar la sub y sobredosificación de los animales. • Aplicar el producto a conciencia. • En el caso de inyectables, desinfectar entre cada aplicación y verificar que la jeringa esté bien regulada. • En el caso de pour on, aplicar sin apuros y con cuidado para no perder producto (no aplicar en días de lluvia o pronóstico de la misma). Previo a la implementación de un cronograma de tratamientos, realizar un bioensayo para evitar fallas en la eficacia del PVG. Uso racional de los PVG El control integrado de garrapatas engloba muchas herramientas; entre ellas, se encuentran el uso racional estratégico y táctico de los PVG dentro del plan sanitario de un establecimiento, diseñado de acuerdo a las condiciones agroecológicas de la zona a lo largo del año y las generaciones de garrapatas presentes en la región. Por uso racional de productos veterinarios garrapaticidas se entiende la correcta selección de los productos veterinarios (según la familia de principios activos), aplicado a un plan sanitario para el control de la garrapata, en el cual se respetan las dosis, vías e indicaciones de uso, considerando al mismo tiempo la alternancia o rotación necesaria del PVG a lo largo del tiempo. Esta variación del producto dependerá del seguimiento de eficacia de los trata- USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 18 �mientos realizados y los diferentes mecanismos de acción. Como resultado, se promueve la máxima extensión de los plazos hasta la aparición de cepas resistentes a las distintas moléculas, preservando los PVG y previniendo la aparición de residuos químicos en los productos cárnicos y lácteos, que atentan contra la inocuidad de los alimentos. Es esencial contar, por un lado, con un bioensayo previo a la selección de los productos que se utilizarán y, por el otro, con un asesoramiento profesional veterinario para el diseño, implementación y seguimiento del plan sanitario para realizar, bajo un control integrado de garrapata en cada establecimiento productivo. Planificación de los tratamientos El propietario de un establecimiento o responsable de los animales, en conjunto con el veterinario asesor sanitario, debe llevar adelante una planificación adecuada. a. Diseñar el plan sanitario anual para los tratamientos garrapaticidas, considerando: • La historia zootécnica del establecimiento y de aplicación de productos. • La rotación de los principios activos, con diferente mecanismo de acción y diferente vía de administración, según la evaluación de la eficacia de los productos ya aplicados (bioensayo). • La bioecología del parásito en la zona donde se encuentra el establecimiento. b. Considerar la realización de un bioensayo antes de la elección de los PVG que se aplicarán, siempre y cuando se puedan recolectar las garrapatas necesarias para ello. c. Gestionar un plan sanitario asociado al control de la garrapata que debe abarcar, al menos, un (1) año calendario e incorporar la menor cantidad de tratamientos posibles. d. Para el caso de los tratamientos garrapaticidas por baños de inmersión: • realizar una correcta cubicación del bañadero de inmersión; • garantizar el uso de la técnica y la preparación correcta, según indicaciones de uso del laboratorio; • considerar el tiempo de inmersión de los animales para un trata- USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 19 �miento adecuado; • respetar la cantidad de pasajes de animales en cada preparación, hasta la reposición y refuerzo del producto (frecuencia de recambio). e. Garantizar la correcta dosificación por animal y el uso estratégico en el caso de los productos inyectables, pour on u otro tipo de aplicación, en conjunto con los baños. f. Planificar los tratamientos endectocidas y de otros ectoparásitos dentro de un plan sanitario, ya que comparten moléculas que afectan a las garrapatas. Por ejemplo, la familia de lactonas macrociclicas, piretroides y fosforados, entre otros (tratamiento químico integrado). g. Seleccionar el PVG y el tipo de aplicación que se realizará según el establecimiento involucrado (disponibilidad de instalaciones), las condiciones agroecológicas (estación del año, temperatura, humedad y nivel de precipitaciones) y el objetivo sanitario (erradicación, control o limpieza de tropas). h. Respetar las indicaciones de cada PVG, en cuanto a los períodos de retiro a faena o periodo de restricción, a fin de garantizar la inocuidad de los productos cárnicos o lácteos, lo cual se evidencia en el cumplimiento de los límites máximos de residuos (LMR), establecidos en la legislación nacional. i. Adoptar estrategias de control que contemplen la convivencia con niveles parasitarios bajos en establecimientos ubicados en zona endémica. j. Realizar la limpieza total de las tropas, de manera selectiva, cuando sean despachadas hacia zonas sin garrapatas. j. Revisar periódicamente los niveles de eficacia de los tratamientos en el rodeo para evaluar la evolución del estatus sanitario y evidenciar una posible resistencia parasitaria. Evitar los tratamientos parciales y tratar a los animales antes del cambio de potrero k Ante la aparición de fallas en la eficacia en los tratamientos garrapticidas y la posterior confirmación de resistencia parasitaria, realizar un análisis integral del plan sanitario y un rediseño de la estrategia de uso de PVG, en la que se tengan en cuenta el control integrado de garrapatas y la bioecología parasitaria en la zona donde se encuentra el establecimiento. En todos los casos, deben leerse las indicaciones e información provista en los impresos (rótulos) de cada producto, para conocer los cuidados y carencias que deben respetarse. Además, se recuerda que el envío de animales a faena debe realizarse respetando los períodos de carencia de cada principio activo, los cuales pueden ser consultados en cada prospecto del producto veterinario aplicado. Se recomienda complementar la lectura del presente manual con el “Instructivo de toma de muestra de interés en garrapata” y la “Guía de manejo responsable de residuos por el uso de garrapaticidas”. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 20 �Contacto Programa de Garrapata del Bovino Correo electrónico: garrapatas@senasa.gob.ar Teléfono: (11) 3144-1973 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de procedimiento. Uso correcto de bañaderos y productos veterinarios garrapaticidas Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0174 Abstract A summary of the resource. El presente manual está destinado a productores, veterinarios y profesionales del ámbito rural. Esta publicación tiene como propósito informar sobre trata�mientos garrapaticidas prolijos y eficientes, para lograr que el producto apli�cado exprese su máximo potencial de efecto ixodicida sobre la población de garrapatas presente en el animal, minimizando así los tiempos de aparición de la resistencia a las diferentes moléculas. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivo Bañaderos: de inmersión y de aspersión Emplazamiento común Estructura básica común a ambos bañaderos Infraestructura de bañaderos de inmersión Especificaciones Cubicación Elementos Manejo Infraestructura de bañaderos de aspersión Principales características Especificaciones Limpieza de tropas para despacho y protocolos Protocolo con baño de inmersión Protocolo con productos pour on o inyectables Uso de productos veterinarios garrapaticidas distintos de balneación Uso racional de los PVG Planificación de los tratamientos Contacto Enfermedades de los Bovinos Garrapatas https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/5e0c5d5381c068af11b61f8694273086.pdf 22b75ee81f115b49206c3ce15666c2a5 PDF Text Text MANUAL DE USO DE LACOORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO MANUAL PARA EL USO DE LA PLATAFORMA WEBCENTRIX Guía paso a paso para el correcto uso de la plataforma Edición 2024 �Índice Introducción 3 Objetivo 3 Procedimiento 3 1. Ingreso a la plataforma 3 2. Verificar la conexión a internet 3 3. Filtros 4 4. Estado de agentes 5 5. Estado del caso 5 6. Base de conocimiento 5 7. Transferencia de casos 6 8. Tipificar o etiquetar los casos 7 9. Email saliente 8 10. Despedida 9 11. Cerrar los casos que no se están gestionado 11 12. La importancia de cerrar sesión 12 Otros usos de la plataforma para el trabajo diario Edición 2024 12 �Introducción El presente documento describe los lineamientos establecidos para el uso por parte de usuarios internos de la plataforma WebCentrix implementada en el Senasa. Objetivo Brindar asistencia a los usuarios de la plataforma mediante instrucciones necesarias para el correcto uso de la plataforma WebCentrix. Procedimiento 1. Ingreso a la plataforma Para comenzar, ingresar al enlace https://login.wcx.cloud/ con usuario y contraseña. 2. Verificar la conexión a internet Para identificar si la plataforma está recibiendo el ancho de banda mínimo requerido para su normal funcionamiento. Para ello, cliquear en el ícono de WiFi que figura en la barra superior de la plataforma y luego elegir la opción “Últimos eventos”. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 3 �En caso de que el agente cuente con inconvenientes en la conexión a internet, la opción “Últimos eventos” mostrará un listado de las fallas de la conectividad detallando la fecha y hora en la que se detecta el inconveniente y, en caso de corresponder, el número de caso que ha sido afectado. Caso contrario, mostrará que no hubo problemas de conectividad. 3. Filtros Se recomienda usar siempre el filtro “Mis casos sin resolver”. De esta manera se pueden visualizar los casos que cada usuario tiene que resolver y que el sistema le asignó. En una primera instancia, los casos le llegan a los operadores generales (Responde operador 1, Responde operador 3); son estos operadores los que transfieren los casos al resto de los usuarios. Si el operador tiene un caso en su bandeja de entrada, le llegará un correo electrónico. Recordatorio: Responde operador 1 y Responde operador 3 son los usuarios que utilizan los operadores de la CDeIC. Ocasionalmente, cuando hay mucha demanda de atención, también utilizan Responde operador 4. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 4 �4. Estado de agentes Los estados permiten indicarle a la plataforma en qué momento el agente se encuentra habilitado para atender. • Disponible: es el estado que habilita a la plataforma a asignar casos al agente. • No disponible: estos estados imposibilitan la asignación de casos, dado que indican que el agente no está disponible para gestionar. • Invisible: este estado tiene el mismo funcionamiento que los estados de color rojo. Si el estado es no disponible (rojo) o invisible (gris) no se realiza la transferencia del caso ya que no hay certeza de disponibilidad. 5. Estado del caso Se recomienda usar los siguientes estados: • ABIERTO: el caso no se gestionó y requiere atención. • CERRADO: el caso se gestionó y se resolvió. Existen otros estados, por ejemplo: • RESUELTO: una vez gestionada la consulta, se puede seleccionar esta opción, sin embargo, es importante tener en cuenta que el sistema necesita que el caso se encuentre CERRADO para que las métricas estén al día. • ESPERA (Cliente): Una vez trasferido el caso va a permanecer en la bandeja de entrada en el estado “Espera de cliente” para su gestión. De esta manera se va a poder continuar con la conversación. 6. Base de conocimiento Una base de conocimiento es una herramienta interna que nos brinda la plataforma Wise. Contiene información y datos sobre diferentes temas, los cuales se desprenden de las consultas más recurrentes de los diversos públicos del Senasa. Se utiliza para agilizar la atención ciudadana. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 5 �¿Cómo acceder? Iniciada la conversación, podemos utilizar plantillas para responder consultas. Se accede a la base de conocimiento escribiendo @ en el cuerpo de texto. Se selecciona la plantilla y automáticamente aparece el texto en el cuerpo del mensaje. En la Guía de apoyo para operadores de WhatsApp se encuentran las plantillas vigentes para consulta. Los operadores pueden sugerir plantillas para continuar alimentando la base a través de responde@senasa.gob.ar 7. Transferencia de casos Si lo que necesitamos es derivar un caso a otro operador, debemos usar la opción “Transferir”, que se ubica en el mismo apartado inferior del caso donde se encuentran Nota, Recordatorio e Email saliente: MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 6 �Si el operador recibe un caso que no es de su competencia, puede transferirlo al usuario que corresponda o a los operadores generales: Responde operador 1 y Responder operador 3. A continuación, aparecerá una lista con todos los operadores. Allí, el color verde da referencia al estado de conexión del mismo, luego seleccionar el usuario y la transferencia estará completa (un cartel verde en el margen inferior derecho indicará esto con la leyenda “Transferencia correcta”). 8. Tipificar o etiquetar los casos Las etiquetas sirven para señalar información genérica sobre el caso. Mientras que el tipo identifica el motivo de la consulta del cliente. Ambos sirven para aportar mayor información sobre los casos y facilitar los reportes que puede brindarnos el Analytics. De esta manera podemos ver, por ejemplo, cuales fueron mensualmente las consultas con mayor demanda. Una vez tipificado el caso, se cierra, cambiando su estado de abierto a cerrado. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 7 �9. E-mail saliente Esta herramienta se utiliza cuando el usuario abandonó la conversación o se interrumpió. Si es un WhatsApp, pasadas las 24 horas de su ingreso cliquear en “Cancelar”, luego en la pluma y seleccionar “E-mail saliente”. En “Destinatario” introducir el correo electrónico del usuario. Luego, en el cuerpo del mensaje se puede utilizar la plantilla @chatsuspendido. La plantilla predeterminada es parte de la base de conocimiento y ayudará a realizar este tipo de gestiones con mayor rapidez. Recordatorio: para acceder a las plantillas se tiene que escribir “@” y luego la palabra en minúscula. Por ejemplo, @chatsuspendido MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 8 �10. Despedida Al finalizar la conversación, es importante utilizar la plantilla @despedida. La misma es predeterminada y automáticamente se envía la encuesta de satisfacción de atención a la persona que se contactó. Para continuar con una atención personalizada, cada operador deberá firmar con su nombre al despedirse. Notas: La plataforma de WebCentrix posibilita registrar notas en los casos. Estas serán de uso exclusivamente interno, es decir, solo serán visibles para los usuarios de la plataforma. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 9 �En la parte inferior del caso, figuran las siguientes opciones: Haciendo click en “Nota” se ingresa a un campo de texto, donde podemos escribir lo que consideremos de relevancia en ese caso. Una vez escrita la información, guardamos la nota. La nota guardada se va a visualizar de la siguiente manera: MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 10 �Acceso histórico de casos Al abrir un caso podemos acceder al “Histórico”. Se trata de un resumen donde se pueden leer los casos de ese usuario, cuando se comunicó, el motivo de la consulta y las conversaciones que se mantuvieron con los operadores. Este recurso puede ayudar a resolver una consulta, si la persona se comunicó previamente. El “Histórico” va a agrupar los casos cuyos campos identificatorios de la persona que se comunicó se encuentren completos (email, nombre, teléfono). Por ejemplo, si dos casos distintos están registrados bajo el mismo correo electrónico, la plataforma va a identificar que se trata del mismo usuario y va a compilarlo en el “Histórico“. Si una persona genera dos casos de dos celulares diferentes –o desde dos correos electrónicos– la plataforma no tiene forma de determinar que se trata de la misma persona y los contemplan como dos usuarios distintos. 11. Cerrar los casos que no se están gestionado Al abrir un caso, el sistema genera un acceso directo colocándolo en la barra superior de la plataforma para poder navegar de forma práctica entre los casos que se están gestionando. Mientras un caso se encuentre en la barra superior como acceso directo, el mismo será bloqueado por el agente y la plataforma limitará la edición del mismo por parte de otro agente que lo abra. Por esto, se recomienda cerrar los casos que no se están gestionando para que puedan ser editados por otros agentes. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 11 �12. La importancia de cerrar sesión Finalizada la jornada de atención, chequear en la bandeja que los casos estén etiquetados, tipificados y cerrados. Luego, cambiar el propio estado a “No Disponible” y cerrar sesión. Es importante que cada agente cierre la sesión de la plataforma al finalizar su jornada para evitar la asignación de casos mientras no se encuentra operativo. Otros usos de la plataforma para el trabajo diario Otras opciones para aprovechar el uso de la plataforma son Registros y Contactos. En el caso de querer un registro accesible a todas las atenciones (presenciales, telefónicas, correos) la plataforma cuenta con un sistema de creación de casos por tickets en el cual se pueden dejar asentadas todas las conversaciones y una lista de contactos. A través de la opción “Nuevo” que se encuentra ubicada en la barra superior a la derecha, se puede generar un nuevo caso saliente desde los canales configurados. Esta opción permite registrar el trabajo diario de cada operador. Haciendo click, se habilitará un desplegable con los canales habilitados para elegir a través de cuál crear el nuevo ticket. El canal para seleccionar es el de “E-mail saliente”. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 12 �A continuación, se habilitará un recuadro donde se podrán hacer las siguientes acciones: • Seleccionar un contacto existente: por defecto aparecerá el contacto que corresponde al último caso que se haya abierto. Si es necesario, se puede buscar un contacto existente desde el buscador. • Agregar un nuevo contacto. • Elegir el grupo de atención desde el cual se enviará el caso. En la barra que se encuentra debajo de “Nuevo caso”, se podrá filtrar por correo electrónico si el contacto es existente. También, se le podrá asignar un Grupo de Atención, por ejemplo, “Siap Operadores Generales”. De esta manera, ese contacto estará en la lista de contactos de ese grupo. Si el contacto no se encuentra registrado, puede ser creado cliqueando en la de la bandeja principal: MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 13 �A continuación, cliquear en “Nuevo Contacto”. Luego de completar los datos solicitados, se puede guardar y crear el contacto: Si se requiere bajar una copia de la conversación con el usuario, existe la posibilidad de hacerlo desde la opción “Imprimir caso” en “Detalle del caso”. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 14 �El caso se va a visualizar de la siguiente manera: Haciendo click en “imprimir”, se podrá Guardar en pdf la conversación o imprimirla. En el caso de necesitar un reporte de los casos atendidos, escribir a los agentes Alexander Sothmann (1148891863) o Celeste Marciano (1140512518). MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 15 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual para el uso de la plataforma webcentrix Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0173 Abstract A summary of the resource. El presente documento describe los lineamientos establecidos para el uso por parte de usuarios internos de la plataforma WebCentrix implementada en el Senasa. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivo Procedimiento 1. Ingreso a la plataforma 2. Verificar la conexión a internet 3. Filtros 4. Estado de agentes 5. Estado del caso 6. Base de conocimiento 7. Transferencia de casos 8. Tipificar o etiquetar los casos 9. Email saliente 10. Despedida 11. Cerrar los casos que no se están gestionado 12. La importancia de cerrar sesión Otros usos de la plataforma para el trabajo diario https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/b9924896c01dde1711823673bd338738.pdf f15b4e788ac942f225cf87ff990cd590 PDF Text Text INSTRUCTIVO SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) Edición 2024 �Introducción La Solicitud de Licencia Anual Ordinaria (LAO) deberá gestionarse por el sistema GDE a través del módulo GEDO. El presente instructivo es de uso interno para los agentes del Senasa y está destinado a aquellas personas que deben presentar la solicitud de su licencia anual ordinaria. A continuación se detallan los pasos que se deberán seguir y se recuerda, que esta licencia deberá estar firmada por el solicitante, autorizada por el superior inmediato y se deberá enviar al referente de Recursos Humanos correspondiente. La solicitud de la licencia por GDE debe realizarse hasta 15 días antes de su usufructo. Procedimiento 1. Ingresar al Portal GDE, con su clave y usuario. 2. Ingresar en Generador Electrónico de Documentos Oficiales (GEDO) y seleccionar la opción Inicio de Documento. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 2 �3. Buscar en la lupa el formulario el acrónimo FSOLI, y seleccionar dicho formulario. 4. Una vez seleccionado, se cierra la solapa y se selecciona Cargar Usuarios Firmantes para que se abra la ventana Firma Conjunta. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 3 �5. En Firma Conjunta se deberá agregar el usuario de quien solicita la licencia y, a continuación, en la ventana de Confirmación hacer clic en la opción NO (ya que no es necesario agregar un usuario revisor). 6. Luego, en la ventana Firma Conjunta se agrega el usuario del superior inmediato que será el encargado de aprobar o rechazar la solicitud1. Nuevamente, para la Confirmación cliquear en NO agregar un usuario revisor. 1. Tené en cuenta que en la tabla que presenta los usuarios debe quedar en primer lugar el nombre del solicitante y debajo el nombre del superior inmediato. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 4 �7. Una vez cargados los dos usuarios firmantes, cliquear en Guardar. 8. Se regresa a la ventana principal donde se deberá cliquear en Destinatarios a fin de colocar a los usuarios que recibirán la comunicación. • En el caso de los centros regionales: Los destinatarios de este formulario deben ser los referentes de Recursos Humanos en los centros regionales. • En el caso de la sede central: Los destinatarios de este formulario deben ser los referentes de Recursos Humanos y los usuarios de las agentes que componen el área de Contralor de la Dirección de Recursos Humanos. Una vez cargados todos los usuarios, seleccionar la opción Aceptar. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 5 �9. Regresar a la ventana principal donde se deberá cliquear en la opción Producirlo yo mismo a fin de completar la solicitud. En Referencia, completar Apellido, Nombre y CUIL– LAO, con respecto al usuario solicitante. 10. En Asunto desplegar el menú para seleccionar 09 A) Licencia Anual Ordinaria. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 6 �11. Completar los campos Nombre, Apellido, N° de CUIL y para Tipo de Convenio desplegar el menú y colocar Otros, en Especificar escribir Senasa y en Repartición desplegar la lupa para escribir # según su dirección nacional, centro regional o unidad de dependencia, luego seleccionarla. Consejo: para que sea más sencillo ubicar tu repartición, se recomienda escribir #Senasa y buscar la que corresponde a tu asiento de funciones dentro de las opciones disponibles. 12. En el apartado Licencia se deben completar las fechas en que serán usufructuados los días. En primer lugar, se completa el Año al que corresponden (según lo que posea cada agente), luego la Fecha desde, la Fecha hasta y los Días en total. En este apartado, si se quisiera colocar más de un período, se puede agregar cliqueando en + para que se habilite otro apartado para ser completado de igual manera. 13. En el apartado Domicilio particular se deben completar todos los campos (Dirección, N°, Piso, Dto., Localidad y Teléfono –solo acepta números sin guiones ni símbolos-). INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 7 �14. En el apartado Observaciones generales se debe completar obligatoriamente el campo Motivo de la licencia, en la cual se puede escribir simplemente Vacaciones. Los campos Comprobantes adjuntos y Observaciones son opcionales por lo que se pueden dejar en blanco. 15. Una vez completada la solicitud, tildar la opción Quiero recibir un aviso cuando el documento se firme. Posteriormente, cliquear en Enviar a Firmar. Finalmente, en Confirmación, cliquear en NO seleccionar usuario revisor. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 8 �16. Una vez terminado, GDE nos dará la información de que el proceso de firma se ha iniciado correctamente. En Mis Tareas encontrará el documento disponible para proceder a la firma, para ello, seleccionar la flecha a la derecha de Ejecutar en la columna Acciones. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 9 �17. Una vez dentro del documento, se firma cliqueando Firmar con Certificado. Luego de ser firmado, el documento desaparecerá de Mis Tareas ya que se ha dirigido para que lo firme el superior inmediato indicado. 18. Cuando el superior inmediato, desde su usuario GDE, realice también su proceso de firma el proceso habrá finalizado y todos los destinatarios que se colocaron en el paso 8 recibirán el documento correspondiente. De esta forma, se da por finalizado el proceso de solicitud de licencia anual ordinaria Ante cualquier duda, consulte con su Referente de RRHH. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE LICENCIA ANUAL ORDINARIA (LAO) 10 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Instructivo. Solicitud de Licencia Anual Ordinaria (LAO) Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0172 Abstract A summary of the resource. El presente instructivo es de uso interno para los agentes del Senasa y está destinado a aquellas personas que deben presentar la solicitud de su licencia anual ordinaria https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/1a77e6c053c5166e555e747c58eb26bf.pdf 8d6a21740793efd2374026a64b58a03f PDF Text Text INSTRUCTIVO. CAMBIO DE CLAVE DE LA CUENTA INSTITUCIONAL INSTRUCTIVO CAMBIO DE CLAVE DE LA CUENTA INSTITUCIONAL EDICIÓN 2024 �Introducción El presente instructivo es de uso interno para los agentes del Senasa y está destinado a aquellas personas que desean modificar la clave de sus cuentas institucionales (es la misma para el correo, los sistemas, la intranet, la nube, etc.)1 Procedimiento 1. Ingresá a la intranet con tu usuario y clave actual. 2. Desde el menú principal de la izquierda, ingresá a “Aplicaciones”. 1 Con excepción de la clave del dominio (que es la contraseña para iniciar en la pc). INSTRUCTIVO. CAMBIO DE CLAVE DE LA CUENTA INSTITUCIONAL 2 �3. Luego, accedé a “Mi portal de Aplicaciones”. 4. Este apartado solicitará nuevamente tu usuario y clave actual. 5. Una vez dentro del menú principal, seleccioná “Cambio de clave”. INSTRUCTIVO. CAMBIO DE CLAVE DE LA CUENTA INSTITUCIONAL 3 �6. El procedimiento te solicitará la clave actual y escribir dos veces la nueva. Una vez realizado este paso, seleccioná “Cambiar”. Tené en cuenta que tu nueva contraseña deberá tener –como mínimo– 10 caracteres, 1 mayúscula, 1 número y un carácter especial (por ejemplo: #, % o &). ¡No te olvides de seguir las recomendaciones para elaborar contraseñas seguras! INSTRUCTIVO. CAMBIO DE CLAVE DE LA CUENTA INSTITUCIONAL 4 �7. Si los datos requeridos fueron bien ingresados, verás la leyenda “Clave cambiada con éxito”. ¡Listo! Ya podés utilizar tu nueva clave. Si no podés cambiarla o se bloquea, contactate con la Mesa de Ayuda de la DTI a través de sus canales: • Asistente virtual • 4121-5005 • mesadeayuda@senasa.gob.ar ¿Consultas? Referentes de Informática INSTRUCTIVO. CAMBIO DE CLAVE DE LA CUENTA INSTITUCIONAL 5 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Instructivo. Cambio de clave de la cuenta institucional Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0171 Abstract A summary of the resource. El presente instructivo es de uso interno para los agentes del Senasa y está destinado a aquellas personas que desean modificar la clave de sus cuentas institucionales (es la misma para el correo, los sistemas, la intranet, la nube, etc.) https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/6d84c06ae5409c4a495293f828feb85b.pdf 2d61642ea18442889d11f4e7d7874abb PDF Text Text Solicitud de vacunas RB51 y Delta-PGM contra brucelosis bovina y carga de acta Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa de Brucelosis bovina Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 4 Solicitud de uso 4 Autorización de solicitud de uso de la vacuna brucelosis RB51 y 9 Delta-PGM Consulta del veterinario acreditado 12 Motivos de rechazo de la solicitud de vacuna 15 Carga del acta de vacunación estratégica 16 Contacto 23 �Introducción La vacunación estratégica del Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina —dispuesta por la Resolución Senasa N.° 957/24 y su modificatoria N.° 936/2025— contempla el uso de vacunas RB51 o DELTA-PGM, aplicables a vacas adultas de establecimientos con casos de brucelosis. El presente instructivo tiene como propósito disponer de una herramienta que guíe al veterinario acreditado en brucelosis bovina para gestionar la solicitud de uso y registro de inoculación con estas cepas. La aplicación de esta vacuna es de carácter voluntario y, en caso de que el profesional acreditado lo indique, el establecimiento deberá reunir las siguientes condiciones: • Los animales deben estar previamente vacunados con cepa 19 y las actas tendrán que estar cargadas en el Sistema Integrado de Gestión de Sanidad Animal (SIGSA). • El Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (Renspa) debe tener estatus asignado: libre, negativo o caso. • La UP que posea antecedente de “Caso” debe contar con una serología no mayor a 6 meses de antigüedad, previamente registrada en el SIGSA. • La existencia de vacas de la UP debe ser mayor o igual a la cantidad de dosis solicitada. Solicitud de uso Si el establecimiento reúne las condiciones, el veterinario acreditado deberá cargar una solicitud de uso para habilitar la compra de la misma y poder hacer uso de la vacuna luego de su aprobación. Para cargar la solicitud, el veterinario acreditado debe ingresar a través del sitio web de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero (ARCA) ingresando con su número de CUIT y clave fiscal. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 4 �Allí, en el apartado de “Mis Servicios” podrá acceder al botón SIGSA. El sistema lo redirigirá al sitio web del SIGSA, donde deberá seleccionar como perfil de uso la opción de Veterinario Acreditado Brucelosis. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 5 �Al ingresar al SIGSA como Veterinario Acreditado Brucelosis, verificar que se encuentra en vista bovinos y dirigirse a: Sanitario – Brucelosis – Nueva Solicitud Vacunas. Luego, se desglosa un listado en el cual se deberá seleccionar la opción “Nueva Solicitud de Vacunas”. Posteriormente, se requerirá completar el campo de Unidad Productiva con el número de Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (Renspa) del establecimiento que se deberá vacunar. Luego, hacer click en el botón “Registrar”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 6 �A continuación, se abrirá una nueva pantalla con el título “Listado de Unidades Productivas”. Allí, se tendrá que cargar nuevamente el número de Renspa en el campo donde lo solicita. Luego, indicar la opción “Buscar”. En la siguiente pantalla, se deberá seleccionar al establecimiento involucrado. Posteriormente, aparecerá una nueva pantalla titulada “Nueva Solicitud de Vacunas Brucelosis”, donde aparecerá el Renspa indicado. Allí se deberá completar el campo de “Veterinario Responsable” haciendo click en “Buscar” e indicando el nombre del veterinario en cuestión. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 7 �Debajo de la búsqueda, podrá observar el nombre del veterinario acreditado con su número de CUIT. Si los datos son correctos, indicar la opción “Seleccionar”. Luego, el sistema redirigirá a la pantalla de “Nueva Solicitud de Vacunas Brucelosis”, donde se observarán los datos de la Unidad Productiva, Titular, Establecimiento, Veterinario Responsable. En esta oportunidad, se tendrá que agregar la cantidad de dosis de vacuna requerida (considerando que es un requisito fundamental que coincida con el número de bovinos para vacunar). Luego de corroborar los datos, hacer clic en “Registrar”. Es importante tener en cuenta previamente el stock de vacas del establecimiento antes de realizar la acción sanitaria. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 8 �En la siguiente pantalla se observará que la solicitud emitida se encuentra en estado “Pendiente”. Para finalizar el proceso, el productor o titular del Renspa deberá aceptar o rechazar la solicitud. Autorización de solicitud de uso de la vacuna brucelosis RB51 y Delta-PGM Para autorizar la solicitud, el titular de la unidad productiva (UP) deberá acceder al sitio web de ARCA con su CUIT y clave fiscal, dirigirse a “Mis Servicios” y, posteriormente, ingresar al SIGSA. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 9 �Al ingresar al SIGSA como productor agropecuario, dirigirse a la ventana “Sanitario”, acceder a la opción “Brucelosis” e ingresar “Consultar solicitudes de vacunas”. Al ingresar, se deberá indicar el Renspa para el cual se hizo la solicitud y hacer click en “Buscar”. Posteriormente, se desplegará el siguiente listado que contempla las solicitudes realizadas para ese Renspa. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 10 �Allí podrá observar el número de solicitud, el Renspa, quién fue el veterinario solicitante, la cantidad de dosis solicitadas, el estado Pendiente, la fecha de la solicitud y la pestaña de Acciones. En esta última pantalla se deberá acceder en el ícono para visualizar el detalle de la solicitud pendiente. Al acceder al detalle, la siguiente pantalla brinda los datos: número de solicitud, fecha de solicitud, datos completos de la UP, nombre del veterinario y cantidad de dosis solicitadas. Al describir el estado como Pendiente, el productor deberá autorizar o rechazar la solicitud. Al autorizar la solicitud, el sistema realiza el cambio de “Pendiente” a “Autorizado por el productor” y permite emitir la Constancia de uso de vacunación estratégica de brucelosis, la cual autoriza a la compra de las dosis de vacuna y tiene una fecha de límite de uso para ser utilizada. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 11 �La autorización de uso de las vacunas tiene una fecha de vencimiento de 60 días luego de la fecha de solicitud. Consulta del veterinario acreditado Luego de la autorización realizada por el productor o titular del Renspa, el veterinario acreditado podrá consultar el estado de su solicitud. Para ello, deberá acceder al SIGSA, ingresar a la ventana “Sanitario”, luego a “Brucelosis +” y seleccionar “Consultar Solicitudes Vacunas”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 12 �Allí deberá indicar el número de Renspa del establecimiento involucrado en la gestión y hacer clic en “Buscar”. Luego, se podrá visualizar el listado de solicitudes de vacunas de brucelosis generadas por el veterinario acreditado al Renspa seleccionado. El productor deberá autorizar aquellas solicitudes que continúen en estado “Pendiente”. Las que figuren como “Autorizada por el Productor” ya se encuentran listas para obtener la Constancia. A través del ícono del panel “Acciones”, se abrirá la siguiente pestaña: INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 13 �En la opción “Constancia”, el usuario podrá generar el documento e imprimirlo. Con este certificado de uso puede dirigirse a cualquier centro distribuidor de la vacuna para realizar la compra, la cual será solicitada por el vendedor. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 14 �Motivos de rechazo de la solicitud de vacuna Al momento de ingresar el Renspa de una UP en una nueva solicitud, se deberá colocar el nombre del veterinario responsable y la cantidad de dosis requeridas. Luego, el solicitante deberá hacer clic en “Registrar”. Si el sistema rechaza la solicitud, significa que la UP no cumple con la totalidad de las condiciones que debe reunir para su aprobación: • Que el establecimiento se encuentre sin estatus sanitario. • Que no se encuentre registrada una serología en los últimos 6 meses en establecimientos con estatus de “Caso”. • Que no tenga registro de la vacunación de cepa 19. • Que no cuente con stock de vacas. El sistema le informará al solicitante cuál es la condición o condiciones que no cumple. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 15 �Si la cantidad de dosis supera el stock de vacas declaradas en el SIGSA, se rechazará la solicitud. Las vacunas solicitadas por el acreditado deben ser igual o menor a la cantidad de vacas. Carga del acta de vacunación estratégica Una vez realizada la vacunación estratégica se deberá cargar un acta de vacunación para registrar el uso. El veterinario acreditado en brucelosis debe ingresar en el SIGSA y seleccionar el perfil de usuario “Veterinario Acreditado Brucelosis”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 16 �Luego, el usuario deberá desplegar la ventana “Sanitario”, ingresar en “Brucelosis +” y hacer clic en “Nueva Acta”. Allí se tendrá que cargar el número de Renspa de la UP. Si los datos que arroja el sistema son correctos, ingresar la opción “Seleccionar”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 17 �En la siguiente ventana, se podrán visualizar dos opciones en la columna “Acciones”: una contempla el listado del stock del establecimiento y la otra, a través del ícono , permite abrir una pestaña para la carga de actas de vacunación. Al ingresar, se despliega la ventana “Nueva acta de Brucelosis”. Allí es importante completar todos los datos correspondientes a la vacunación. Al tratarse de un acta de vacunación estratégica, en la opción “Estratégica RB51/DELTA PGM” se deberá cambiar la palabra “NO” e indicar “SI”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 18 �La modificación genera que la categoría por vacunar cambie de ternera a vaca. Desde este momento, se visualizará el stock de vacas de la UP y se podrá continuar con la carga de todos los campos. En la opción “Vacunador” se deberá hacer clic en el botón “Buscar” para que el sistema arroje el nombre y los datos del veterinario acreditado. En la siguiente ventana se indicará el número de CUIT correspondiente al vacunador y, posteriormente, se desplegará la lista de roles. Allí se deberá dirigir al panel de “Acciones” y seleccionar en el ícono de la opción “Acreditado Veterinario Brucelosis”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 19 �Luego, el acreditado deberá continuar con la cantidad de dosis utilizadas, la fecha de la vacunación y un número de acta a elección. En el ítem “Vacuna” se deberá seleccionar el botón “Buscar”. Posteriormente, se abrirá una pestaña para observar el listado de las vacunas e indicar la marca utilizada. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 20 �Luego de agregar la marca de la vacuna aplicada, se deberá agregar el número de serie y seleccionar el botón “Guardar”. . Para consultar el acta, se deberá ingresar nuevamente al SIGSA, pero con el perfil de “Productor agropecuario”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 21 �Al ingresar al sistema, se deberá dirigir a la ventana “Sanitario”, ingresar en “Brucelosis +” y seleccionar “Consultar actas”. Luego, se deberá indicar el número de Renspa y seleccionar el botón de “Buscar”. Allí se podrán visualizar las actas de vacunación. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 22 �En el panel de “Acciones”, al hacer clic en el ícono registrada. se observará el acta Contacto Programa de Brucelosis bovina Correo electrónico: brucelosisbovina@senasa.gob.ar INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 23 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Solicitud de vacunas RB51 y Delta-PGM contra brucelosis bovina y carga de acta Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa de Brucelosis bovina Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Relation A related resource Resolución Senasa 957/24 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0170 Abstract A summary of the resource. El presente instructivo tiene como propósito disponer de una herramienta que guíe al veterinario acreditado en brucelosis bovina en la solicitud de uso y registro de vacunas RB51 o DELTA-PGM para ser aplicadas en vacas adultas pertenecientes a establecimientos con casos de brucelosis. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Indice Introducción Solicitud de uso Autorización de solicitud de uso de la vacuna brucelosis RB51 y Delta-PGM Consulta del veterinario acreditado Motivos de rechazo de la solicitud de vacuna Carga del acta de vacunación estratégica Contacto Brucelosis SISTEMAS INFORMATICOS Veterinarios https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/b2d115427a56298f09e9260a6d425b84.pdf cbdd6dff35fdd40f3030963e5ff33ee9 PDF Text Text Instructivo para la toma de muestras de interés en garrapata del bovino Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2024 �Introducción El presente instructivo detalla cuáles son las muestras con mayor relevancia y de interés sanitario en garrapata del bovino. La toma de muestras para la clasificación taxonómica es fundamental en los procedimientos de inspección sanitaria donde interviene el Senasa. A partir de estas, es posible efectuar la determinación del género y la especie de las diferentes garrapatas que pueden parasitar a los animales. Toma de muestras Consideraciones generales sobre el procedimiento Con el objetivo de lograr un correcto manejo de los productos garrapaticidas, es posible realizar dos tomas de muestras importantes en un establecimiento: una es del bañadero de inmersión, a los fines de determinar la concentración del principio activo; la otra es la recolección de muestras de garrapatas para determinación del análisis de sensibilidad a productos veterinarios garrapaticidas (bioensayo). Por lo general, se sugiere que ambos procedimientos se realicen en simultáneo, para así obtener un panorama más amplio de la situación del establecimiento y lograr un diagnóstico certero. Para clasificación taxonómica a. Proceder al desprendimiento manual de la garrapata, en lo posible de al menos diez (10) ejemplares, poniendo especial cuidado en no dañar el órgano de fijación (hipostoma). En caso de hallar diferentes estadios sobre el animal, se procederá a recolectar uno (1) de cada uno de ellos. b. Los elementos recogidos deberán colocarse en un envase limpio, seco y bien cerrado para remitirlo antes de las veinticuatro (24) horas al laboratorio. En caso de no poder remitirse en forma inmediata, será conveniente agregar alcohol al setenta por ciento (70 %) para una mejor conservación de la muestra. c. La muestra deberá estar correctamente rotulada y acompañada por el ANEXO II (b) de la Resolución Senasa 382/2017, formulario Toma de muestras para la clasificación taxonómica, para ser remitida a un laboratorio autorizado, según el listado provisto por el Programa y dispuesto en el sitio web oficial del Senasa. INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE INTERÉS EN GARRAPATA DEL BOVINO 3 �Del baño para análisis de la concentración del principio activo Es muy importante realizar esta medición, ya que permite monitorear el estado de la concentración del líquido garrapaticida del bañadero y mantener habilitado el bañadero. Este monitoreo es clave, ya que los factores externos a los cuales está expuesto el líquido garrapaticida (como el sol, barro, lluvia, restos de pelos, secreciones y excreciones de los animales) afectan el pH y por ende la concentración del principio activo. Procedimiento para toma de muestra en baños activos a. En primer lugar, se debe homogeneizar el contenido líquido, es decir, remover el baño con el agitador o removedor durante 10 minutos y luego hacer pasar por el bañadero 30 a 50 animales grandes, con el mismo objetivo. La cantidad de bovinos para remover el baño dependerá del tamaño y volumen de la pileta principal. b. Para realizar esta tarea, se requiere una botella limpia y sin residuos, con una capacidad de 500 ml. Es importante utilizar guantes cuando se realice el procedimiento. INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE INTERÉS EN GARRAPATA DEL BOVINO 4 �c. Luego, se debe atar la botella destapada a la regla y sujetarla bien, a la mitad del nivel de uso de la misma. d. Introducir la regla con la botella. La acción debe ser rápida para que el 80% de su contenido sea del lugar elegido. Al sacar la regla con la muestra, se necesita volcar un tercio del contenido para dejar una cámara de aire. No llenar hasta el tope, sino solo un 75% del volumen. e. Finalmente, se debe cerrar la botella de forma hermética y utilizando la misma tapa de rosca. No usar un corcho, ya que existe la presencia de materia orgánica en el interior de la muestra y el líquido fermenta con facilidad, lo cual ocasiona la expulsión del mismo por su presión. INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE INTERÉS EN GARRAPATA DEL BOVINO 5 �Acondicionamiento de la muestra para el envío al laboratorio a. Para el transporte: la botella debe ser colocada dentro de una caja contenedora con el pico hacia arriba, indicando con una flecha cómo debe mantenerse la posición de la misma. El envío debe realizarse dentro de los 5 días de obtenida la muestra. b. Adjuntar el protocolo de toma de muestra, ANEXO VII de la Resolución Senasa 382/2017, formulario Análisis solución de baño garrapaticida. Es importante avisar telefónicamente al destinatario de la muestra e informar los datos del transporte de envío. c. Si la muestra no se envía inmediatamente deberá conservarse en heladera, dentro de una bolsa bien cerrada y fuera del alcance de los niños. Listado de laboratorios de Red habilitados Se sugiere consultar los laboratorios de Red habilitados por el Senasa para análisis de la concentración de productos garrapaticidas de baños de inmersión (Resolución Senasa 736/06), disponibles en el sitio web oficial del Servicio. Bioensayo Toma y remisión de muestra de garrapatas para análisis de la sensibilidad a los diferentes principios activos Procedimiento de muestreo en establecimiento Para realizar correctamente la toma de muestra se deberá coordinar previamente con el titular de los animales para que reserve un lote de estos sin tratamiento (en donde sí se aplicó algún tratamiento, verificar que haya finalizado el poder residual del producto y esperar los días correspondientes, para que vuelva a levantar larvas y generar teleoginas). Para que la muestra sea representativa, lo ideal es elegir varios animales de los distintos potreros más afectados. Recolección de teleoginas Para realizar el bioensayo se necesita seleccionar garrapatas en estadio de teleogina, es decir, garrapatas que estén bien ingurgitadas. Estas se caracterizan por tener un color grisáceo con tinte verde oliva. INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE INTERÉS EN GARRAPATA DEL BOVINO 6 �Al momento de recolectarlas se deben desprender manualmente, con pequeños movimientos vibratorios y rotatorios, cuidando no dañarlas –particularmente al órgano de fijación (hipostoma)–. Se recomienda recoger entre 80 y 100 teleoginas para poder realizar el perfil completo. Acondicionamiento de la muestra Colocar las teleoginas en un envase limpio y seco (plástico, vidrio o cartón resistente), con pequeñas perforaciones en la tapa para su aireación. Es importante considerar que el envase sea de un tamaño adecuado para que no se encimen unas con otras. Además, se recuerda no colocar algún otro elemento dentro del envase. Envió de la muestra La muestra debe llegar refrigerada y enviada lo más pronto posible al laboratorio. Si no puede enviarse de inmediato, deberá mantenerse refrigerada para evitar la oviposición de las teleoginas. Es importante considerar los tiempos y las distancias al momento de remitir la muestra, ya que debe llegar al laboratorio en un plazo máximo de 72 horas desde su recolección. INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE INTERÉS EN GARRAPATA DEL BOVINO 7 �En caso de enviarse más de un recipiente, cada uno deberá estar numerado junto con su protocolo correspondiente. De no ser posible enviar la muestra de inmediato al laboratorio, la misma deberá almacenarse en un lugar fresco y protegido de la luz del sol (por ejemplo, en la heladera, con un máximo de 4 días). Esto permitirá asegurar la conservación de la muestra y que las garrapatas permanezcan vivas. Si se envían varios recipientes, cada uno debe estar claramente numerado junto con los protocolos correspondientes. Protocolo Cada una de las muestras enviadas deberá estar claramente numerada, junto con su protocolo correspondiente, según el ANEXO IX de la Resolución Senasa 382/2017 Protocolo remisión de muestra de garrapatas para determinación de sensibilidad a garrapaticidas. El formulario deberá confeccionarse por duplicado, ya que uno acompañará a la muestra de envío y el otro quedará como copia de archivo. Cabe aclarar que en el apartado Otros datos de interés se deberán especificar cuántos potreros fueron muestreados. Destino de las muestras Existen diferentes laboratorios que realizan bioensayos, por lo cual se recomienda consultar el más cercano a su jurisdicción en la página web oficial del Senasa. Contacto Programa de Garrapata del Bovino Correo electrónico: garrapatas@senasa.gob.ar Teléfono: (11) 3144-1973 INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE INTERÉS EN GARRAPATA DEL BOVINO 8 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Instructivo para la toma de muestras de interés en garrapata del bovino Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Relation A related resource Resolución Senasa N° 382/2017 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0169 Abstract A summary of the resource. La presente guía detalla cuáles son las muestras con mayor relevancia y de interés sanitario en garrapata del bovino. La toma de muestras para la clasificación taxonómica es fundamental en los procedimientos de inspección sanitaria donde interviene el Senasa. A partir de estas, es posible efectuar la determinación del género y la especie de las diferentes garrapatas que pueden parasitar a los animales. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Toma de muestras Consideraciones generales sobre el procedimiento Para clasificación taxonómica Del baño para análisis de la concentración del principio activo Procedimiento para toma de muestra en baños activos Acondicionamiento de la muestra para el envío al laboratorio Listado de laboratorios de Red habilitados Bioensayo Toma y remisión de muestra de garrapatas para análisis de la sensibilidad a los diferentes principios activos Procedimiento de muestreo en establecimiento Recolección de teleoginas Acondicionamiento de la muestra Envió de la muestra Protocolo Destino de las muestras Enfermedades de los Bovinos Garrapatas https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/8896d6630f56235382f1a091488b59cd.pdf 29d6712c5fe332076b8472b911bf29e1 PDF Text Text DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR PROGRAMA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA PARA LA INFLUENZA AVIAR Y LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE EN AVES Año 2020 1 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 3 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................ 3 3. ESTRATEGIAS DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA ACTIVA ..................................................................... 4 3.1. EN PREDIOS DE AVES DE TRASPATIO ................................................................................................ 4 3.2. EN EXPOSICIONES DE AVES DE RAZA Y ORNAMENTALES ................................................................. 6 3.3. EN NÚCLEOS DE REPRODUCCIÓN ..................................................................................................... 7 3.4 EN GRANJAS DE GALLINA DE POSTURA.............................................................................................. 7 3.5 MUESTREO COMPLEMENTARIO ......................................................................................................... 9 4. DIAGNÓSTICO DE IA Y NC A PARTIR DE LAS MUESTRAS OBTENIDAS EN LA VIGILANCIA EPIDEMILÓGICA ACTIVA ......................................................................................................................... 10 DIAGRAMA DE FLUJO PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y VIROLÓGICO DE LA INFLUENZA AVIAR ...................................................................................................................................................... 12 DIAGRAMA DE FLUJO PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y VIROLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE....................................................................................................................................... 13 2 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR 1. INTRODUCCIÓN El presente documento fue elaborado en forma conjunta entre la Coordinación General de Epidemiología y el Programa de Sanidad Aviar de la Dirección de Planificación y Estrategia de Sanidad Animal dependiente de la Dirección Nacional de Sanidad Animal y tiene como objetivo establecer los criterios y metodologías generales empleadas durante el año 2020 en el programa de vigilancia activa para la influenza aviar de notificación obligatoria (IA) y la enfermedad de Newcastle (NC) dirigido a las subpoblaciones de aves de corral y la vigilancia epidemiológica pasiva en las poblaciones de aves de corral y silvestres. 2. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Demostrar la ausencia de infección y circulación del virus de influenza aviar de notificación obligatoria (VIA) y de las cepas virulentas o patógenas del Virus de la enfermedad de Newcastle (VEN) en las aves domésticas de todo el territorio nacional. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Demostrar la ausencia de infección por VIA y VEN en aves domésticas consideradas de mayor riesgo por su sistema de cría (aves de traspatio o de crianza familiar).  Detectar infecciones subclínicas con cepas de IA de los subtipos H5 y H7 de baja patogenicidad en aves domésticas.  Detectar precozmente la circulación de los VIA y VEN en casos de observación de signos clínicos compatibles o aumentos de mortalidad en aves domésticas y silvestres. 3 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR 3. ESTRATEGIAS DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA ACTIVA 3.1. EN PREDIOS DE AVES DE TRASPATIO El modelo de riesgo de la Influenza aviar y enfermedad de Newcastle, se realizó en base al sistema AVE de información Geográfica para Asistencia en la Vigilancia Epidemiológica. Los factores de riesgo que se consideran asociados a la aparición de estas enfermedades son:  Frontera con Chile  Frontera Norte  Frontera Marítima  Frontera Este  Aeropuertos  Principales Rutas  Zona de migración de aves: contempla humedales, ríos y cuerpos de agua, más sitios RAMSAR* y lugares identificados como de asiento de aves migratorias.  Aves de Traspatio: información proporcionada por el Sistema Integrado de Gestión y Sanidad Animal (SIGSA) y análisis de densidad poblacional.  Distribución de aves comerciales: datos obtenidos del SIGSA. Se utilizó el método de comparación de a pares, donde la importancia relativa de cada factor de riesgo fue ponderada comparando con el resto de los factores de riesgo. Habiendo analizado las muestras de los últimos seis años, se propuso seleccionar las oficinas que realizarán vigilancia de traspatio en base a la actualización del modelo mencionado. * Argentina tiene actualmente 23 sitios designados como Humedales de Importancia Internacional (sitios RASMAR). 4 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR A continuación se presenta el mapa de riesgo (Mapa 1) y las oficinas que poseen una zona significativa de su territorio con un riesgo superior a mediano (Mapa 2). Supuestos: partiendo de una población desconocida (o tendiente a infinito) se presentan los siguientes supuestos:  Nivel de confianza: 95%  Mínima prevalencia esperada de predios positivos: 1%  Mínima prevalencia esperada de aves positivas intrapredio: 20% De  Cantidad promedio de aves por predio: 20  Número de aves a muestrear por establecimiento: 10 acuerdo a estos supuestos se deberán muestrear 306 establecimientos. El diseño asegurará una confianza del 95% de 5 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR detectar uno o más predios de traspatio infectados en las zonas seleccionadas como de mayor riesgo, si la prevalencia de la IA o NC en la población de aves de traspatio de esas zonas, es de por lo menos el 1% y la prevalencia de las aves infectadas es por lo menos el 20%. Se adicionó un 15% más de establecimientos, con el fin de que se cumpla con el mínimo calculado, obteniendo un número de 351 predios a muestrear. Se tomará muestras de sueros de la totalidad de las aves, si el número de aves es menor de 10 ó de 10 aves si el número de aves es mayor o igual a 10. 3.2. EN EXPOSICIONES DE AVES DE RAZA Y ORNAMENTALES En la Argentina la cría de aves de raza pura y ornamental está muy extendida y por lo general se realiza en condiciones de libertad o en semicautiverio en casas de familia en medio urbano, semiurbano o rural. Muchos de estos productores forman parte de las asociaciones de criadores de distintos puntos del país. Los ejemplares reproductores de diferentes tipos (gallinas, patos, pavos, faisanes, etc.) pueden movilizarse de un predio a otro (en número por lo general reducido) o bien pueden asistir a ferias y exposiciones rurales que se hallan bajo control del Senasa (ej. Exposición Rural de Palermo, Chivilcoy, Rauch, Ayacucho, Río Cuarto, Concepción del Uruguay, etc.). Dependiendo de la importancia de la exposición (nacional, provincial o local) asisten aves de algunos o muchos productores y de algunas o varias localidades del país, y una vez culminada la misma los ejemplares pueden volver a su lugar de origen o se trasladan a otro destino. Se deberá tomar muestras de sueros. El número de muestras a tomar será de 10, si el expositor ingresara más de 10 aves, o de la totalidad de las aves si el expositor ingresara menos de 10 aves. 6 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR 3.3. EN NÚCLEOS DE REPRODUCCIÓN Las aves reproductoras son monitoreadas en el marco del muestreo para el Plan Nacional de Sanidad Avícola (PNSA), que contiene el “Programa de control de las micoplasmosis y salmonelosis de las aves y prevención y vigilancia de enfermedades exóticas y de alto riesgo en planteles de reproducción”, como parte de la Resolución SENASA N°882 del 5 de diciembre de 2002. Los laboratorios adheridos al PNSA, deben enviar al laboratorio del SENSA una vez por año, 20 (VEINTE) muestras de suero, correspondientes a cada núcleo/lote de aves reproductoras. Las granjas de aves reproductoras padres o abuelas, se encuentran organizadas en “núcleos”, cada granja puede disponer de uno o varios núcleos. Cada núcleo dispone en general de 2 a 5 galpones. Se considera como unidad epidemiológica al núcleo, ya que las aves dentro del núcleo tienen la misma edad, el mismo origen, reciben el mismo manejo y tratamiento sanitario y están bajo el control de la misma persona (por lo general exclusiva para cada núcleo). 3.4 EN GRANJAS DE GALLINA DE POSTURA Para optimizar las visitas a estos establecimientos, esta tarea se programó para trabajar de manera conjunta con la Coordinación General de Vigilancia y Alerta de Residuos y Contaminantes (COVARC), dependiente de la DIRECCION NACIONAL DE INOCUIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Este estudio está dirigido a los establecimientos de explotación comercial, de todo el territorio nacional. Dentro de las diferentes explotaciones comerciales, se focaliza en la subpoblación de gallinas de postura, por ser consideradas la de mayor riego debido a la presencia de aves de diferentes edades dentro de la granja y a su largo ciclo productivo, lo que resulta en una mayor probabilidad de que una cepa del virus de baja patogenicidad de la influenza aviar pueda circular en una granja sin manifestación clínica de enfermedad. 7 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR Diseño: “aleatorio en dos etapas” para la detección del VIA. Supuestos: partiendo de una población de 43,1 millones de gallinas de postura en producción distribuidas en 973 establecimientos con un promedio de 30.000 aves por predio, se definió el tamaño de la muestra considerando los siguientes parámetros y supuestos: Nivel de confianza: 95% Mínima prevalencia esperada de predios positivos: 1% Mínima prevalencia esperada de aves positivas: 15% Cantidad promedio de aves por predio: 30.000 N° de animales a muestrear por lote: 20 De acuerdo a estos parámetros y supuestos se deben muestrear 312 establecimientos. Asignación de predios: Para aumentar la sensibilidad del muestreo se seleccionaron los establecimientos a muestrear en base a ciertos factores de riesgo asociados a la epidemiología de la enfermedad, identificándose las siguientes características:  Proximidad a posibles asentamientos de aves silvestres y migratorias: Establecimientos que se encuentren cercanos a humedales de importancia en la zona por la densidad de aves silvestres o por las especies de aves existentes (patos, gansos y cisnes). Se tomó como referencia un área de 10 km. Se incluyeron cuerpos de agua permanente (lagos, lagunas embalse) e hidrografía permanente (ríos).  Categoría de bioseguridad: Se tuvieron en cuenta aquellos establecimientos que estuvieran registrados en el Sistema Integrado de Sistema de Gestión de Sanidad Animal (SIGSA) en una categoría de bioseguridad baja.  Linderos a establecimientos avícolas de traspatio: Establecimientos ubicados dentro de un radio de 5 km. de distancia a establecimientos de traspatio registrados en el SIGSA. 8 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR  Zona de fronteras: Establecimientos que se encuentren dentro de aproximadamente 100 km de la frontera norte, en las cuales puede existir grupos de aves más expuestos al riesgo por encontrarse en zonas limítrofes con un importante tráfico vecinal fronterizo de aves vivas o productos avícolas.  Establecimientos que se encuentren de aproximadamente 100 km de la frontera con Chile, focalizándolos en los pasos fronterizos que comuniquen con el país vecino. A partir de estas, se realizó la caracterización de la totalidad de los establecimientos productivos del país (registrados en el SIGSA) agrupados por Centro Regional del Senasa. Se realizó la identificación de las diferentes características para cada uno de ellos, asignando un valor de 1 punto a cada factor. La sumatoria de los puntajes otorgados por la presencia de alguno o varios factores en cada establecimiento, permitió clasificarlos de acuerdo al nivel de riesgo, obteniendo un rango de diferente amplitud en cada regional. La selección de los predios se realizó sobre esta subpoblación caracterizada como de mayor riesgo, de manera aleatoria proporcional al número de establecimientos registrados por centro regional. Se deberá tomar muestras de suero de 20 aves por predio. 3.5 MUESTREO COMPLEMENTARIO Durante la Vigilancia Epidemiológica 2019 se encontraron en diferentes explotaciones sueros positivos a Influenza Aviar diferente a H5 y H7. Por lo cual, resulta necesario que los mismos continúen en vigilancia. La cantidad de aves a muestrear dependerá del establecimiento. En esta oportunidad se procederá a tomar sueros e hisopos cloacales u orofaríngeos o traqueales. 9 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR Si el establecimiento corresponde a aves-traspatio se operará de según punto 3.1 y se deberá incorporar al muestreo la misma cantidad de hisopos. Si el establecimiento corresponde a gallinas de postura, se operará según punto 3.4 y se deberá incorporar al muestreo la misma cantidad de hisopos. 4. DIAGNÓSTICO DE IA Y NC A PARTIR DE LAS MUESTRAS OBTENIDAS EN LA VIGILANCIA EPIDEMILÓGICA ACTIVA Las muestras de sueros deberán ser enviadas desde la MEM al Departamento de Enfermedades Exóticas para la realización del diagnóstico serológico para la IA por las técnicas de Elisa multiespecie y/o IDAG, y en caso de serología positiva para influenza aviar tipo A, deberá realizarse Elisa para H5 y H7. Los mismos se deben remitir al Departamento de Aves informando que se debe realizar las pruebas serológicas de HI específico para H5 y H7. En caso de resultados negativos a HI (5 ó 7), deberán procesarse para el resto de los subtipos. Los sueros provenientes de aves de traspatio serán procesados por Departamento de Aves para el diagnóstico serológico por la técnica de Elisa o HI para NC. En caso que los resultados serológicos arrojen un título promedio superior a 5.000 GMT por la prueba de Elisa para NC, ó resulte positiva una serología para IA, se deberá comunicar de manera inmediata a la Dirección de Planificación y Estrategia de Sanidad Animal a: MARCELO.BALLERIO (DPYESA#SENASA) con copia a MARIANO.BACCI (DPYESA#SENASA) y a MARIA.FERRER (DPYESA#SENASA), adjuntando el protocolo con el resultado. 10 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR Según el resultado, se procederá a re muestrear el establecimiento para demostrar la ausencia y/o presencia de infección y circulación del virus de influenza aviar de notificación obligatoria (VIA) y de las cepas virulentas o patógenas del Virus de la enfermedad de Newcastle (VEN). Para el muestreo complementario se procederá enviar los sueros según lo anterior, y las muestras de hisopos deberán ser enviadas al Departamento de Biología Molecular para el diagnóstico de IA por la técnica de rt-RT-PCR. 11 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR DIAGRAMA DE FLUJO PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y VIROLÓGICO DE LA INFLUENZA AVIAR Vigilancia Serológica Vigilancia Virológica Suero Hisopados Informar a la DPYESA Elisa multiespecie y/o IDAG NEGATIVO Ausencia de anticuerpos NEGATIVO HI para el resto de los subtipos de IA POSITIVO NEGATIVO POSITIVO Elisa H5 y H7 RT-PCR Real Time para IA tipo A HI H5 y H7 POSITIVO Investigación virológica y epidemiológica Ausencia de antígeno Inoculación de huevos embrionados rt- PCR Real Time para H5-H7 NEGATIVO HA y mortandad POSITIVO NEGATIVO Secuenciación HA POSITIVO Referencias: HI: inhibición de la hemoaglutinación rt- PCR Real Time: Reacción en cadena de polimerasa en tiempo real IA: influenza Aviar IPIV: Índice de patogenicidad intravenosa HA: hemoaglutinación IAAP: Influenza aviar de alta patogenicidad IABP: Influenza Aviar de baja patogenicidad IAAP IABP Caracterización viral: *Secuenciación *IPIV en pollos IAAP IABP 12 �DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DIRECCIÓN DE PLANIFICACIÓN Y ESTRATEGIA DE SANIDAD ANIMAL PROGRAMA DE SANIDAD AVIAR DIAGRAMA DE FLUJO PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y VIROLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE Vigilancia Serológica r Vigilancia Virológica Elisa o HI Hisopados Título mayor a 5000 GMT Informar a la DPYESA rt- PCR Real Time POSITIVO Secuenciación Identificación de cepa de cepa NEGATIVO Inoculación de huevos embrionado s HA y mortandad NEGATIVO POSITIVOS rt- PCR Real Time POSITIVO Referencias: rt- PCR Real time: Reacción en Cadena de Polimerasa en tiempo real HA: hemoaglutinación HI: inhibición de la hemoaglutinación IPIC: índice de patogenicidad Intracerebral NEGATIVO Caracterización viral *Secuenciación *IPIC en pollos Cepas velogénicas Cepas lentogénicas 13 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Programa. Vigilancia epidemiológica para la influenza aviar y la enfermedad de newcastle en aves. Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2020 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección Nacional de Sanidad Animal Dirección de Planificación y Estrategia de Sanidad Animal Programa de Sanidad Aviar Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0168 Abstract A summary of the resource. El presente documento tiene como objetivo stablecer los criterios y metodologías generales empleadas durante el año 2020 en el programa de vigilancia activa para la influenza aviar de notificación obligatoria (IA) y la enfermedad de Newcastle (NC) dirigido a las subpoblaciones de aves de corral y la vigilancia epidemiológica pasiva en las poblaciones de aves de corral y silvestres. Table Of Contents A list of subunits of the resource. 1. Introducción 2. Objetivos 3. Estrategias de vigilancia epidemiológica activa 3.1. En predios de aves de traspatio 3.2. En exposiciones de aves de raza y ornamentales 3.3. En núcleos de reproducción 3.4 En granjas de gallina de postura 3.5 Muestreo complementario 4. Diagnóstico de IA y NC a partir de las muestras obtenidas en la vigilancia epidemiológica activa Diagrama de flujo para el diagnóstico serológico y virológico de la influenza aviar Diagrama de flujo para el diagnóstico serológico y virológico de la enfermedad de newcastle Enfermedad de Newcastle Influenza Aviar