3 10 171 https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/7d2779ddad6c46950207ea6a7f0b37e4.pdf c3480c1bb80c11113d5559cb09b1e58c PDF Text Text Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza 4 Tropical EN BANANO: CAPACIDAD DIAGNÓSTICA DEL LABORATORIO DEL SENASA M.V. Fernández1, G. Ghersi 1, M. Calderón 1, V. Weingandt 1, A. Rodríguez 2, M. De Gracia 3. 1Dirección de Laboratorio Vegetal, SENASA 2Centro Regional Chaco-Formosa, SENASA 3Dirección de Información Estratégica Fitosanitaria, SENASA Mail: plagas@senasa.gob.ar INTRODUCCIÓN Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza 4 Tropical (Fusarium R4T) es una de las plagas más destructivas del cultivo del banano ya que bloquea el sistema vascular provocando marchitez y muerte de plantas. Categorizada como plaga cuarentenaria ausente en Argentina, su reciente detección en países de América (Colombia, Perú y Venezuela) advierte la importancia de esta nueva amenaza. Se conocen hasta el momento tres razas de F. oxysporum f. sp. cubense (1, 2 y 4), capaces de ocasionar la enfermedad conocida como Mal de Panamá en Musa spp. Pero sólo la R4 afecta a cultivares Cavendish (Grupo AAA) entre otros. En nuestro país se hallan dos regiones productoras: la región NEA, en la provincias de Formosa y Misiones; y la región NOA, en la provincia de Salta y Jujuy. Las variedades empleadas pertenecen al grupo Cavendish, destacando la variedad Nanica por su adaptación a las condiciones climáticas de la región subtropical Argentina. En Formosa además existen algunos cultivos de la “bananita oro” perteneciente al Grupo AAB que es susceptible tanto a Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza 4 como a Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza 1. Ambas razas producen idénticos síntomas. La Raza 1 no representa amenaza para el subgrupo Cavendish (AAA) ya que presenta resistencia al patógeno. OBJETIVOS RESULTADOS A fin de proteger el patrimonio fitosanitario y el sector bananero nacional, el SENASA busca fortalecer el sistema de detección temprana para prevenir el ingreso y establecimiento de esta plaga. Las muestras resultaron negativas para la presencia de Foc R4T mediante la PCR en tiempo real según Aguayo et al., (2017). Los aislamientos y cultivos monospóricos obtenidos fueron identificados como Fusarium oxysporum. En cuanto a la secuenciación de cultivos monospóricos se encontró una identidad superior al 99% con las secuencias correspondientes a Fusarium oxysporum para todos los genes analizados. MATERIALES Y METODOS En diciembre de 2024, en la Provincia de Formosa, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) y el Centro de Validación de Tecnologías Agropecuarias (Cedeva) capacitaron a inspectores fitosanitarios respecto a la enfermedad, sus síntomas y metodología de monitoreo. Complementariamente se tomaron muestras con sintomatología compatible a la enfermedad en bananita oro de la localidad de Laguna Naineck (Figura 1). El tejido vegetal se analizó por qPCR con primers y sonda FWB-R4T para la detección de Fusarium R4T. En paralelo, se obtuvieron aislamientos y cultivos monospóricos los cuales se caracterizaron morfológicamente en base a lo descripto por Nelson et al. (1983) y Leslie & Summerell (2006). Sobre estos se realizó extracción de ADN y posterior secuenciación con los primers TEF, ITS4, ITS5 y β-tubulina. A. B. Figura 2. Aislamientos de Fusarium oxysporum en APG. A. frente. B. reverso. Figura 3. Equipo de monitoreo Senasa - Cedeva DISCUSION Y CONCLUSIONES Se detectó la presencia de Fusarium oxysporum, que resultó negativo para Fusarium R4T por qPCR. El método molecular implementado resultó útil para realizar un diagnóstico rápido a partir de muestras de material vegetal con sospecha de presencia del patógeno. Como resultado de estas acciones, se concluye que el Laboratorio del SENASA se encuentra en condiciones de brindar el respaldo analítico ante la sospecha de la plaga. Referencias Figura 1. Toma de muestras con sintomatología compatible con Foc R4T en bananita oro - García-Bastidas; et al. (2020). Guía Andina Para el Diagnóstico de Fusarium Raza 4 Tropical (RT4) Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Fusarium odoratissimum) Agente Causal de la Marchitez por Fusarium en Musáceas (plátanos y bananos). - Leslie, J. F. & Summerell, B.A. (2006) The Fusarium Laboratory Manual. Blackwell Publishing. Print ISBN:9780813819198 |Online ISBN:9780470278376 |DOI:10.1002/9780470278376. - Nelson, P.E.; Toussoun, T. A. & Marasas, W.F.O. (1983) Fusarium species : an illustrated manual for identification. Pennsylvania State University Press. USA. ISBN 0-271-00349-9. � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource <em>Fusarium oxysporum</em> f. sp.<em> cubense</em> raza 4 tropical en banano: capacidad diagnóstica del laboratorio del SENASA Creator An entity primarily responsible for making the resource Fernández, M.V Ghersi, G. Calderón, M.C Weingandt, V Rodríguez, A De Gracia, M Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Póster académico Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0182 Abstract A summary of the resource. Trabajo presentado en el 6° Congreso Argentino de Fitopatología, realizado en Cipolletti, Argentina entre los días 18 al 20 de Septiembre de 2024.. El presente trabajo describe acciones realizadas por el Laboratorio del SENASA que demuestran condiciones de brindar el respaldo analítico ante la sospecha de la plaga. https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/3617a31ac1c6ba7e4c39c56eef430e5e.pdf 06df64eb610998b0a3dfc968a1ba93ae PDF Text Text Evaluación de la condición fitosanitaria de Xylella fastidiosa en arándano y pecán en las principales regiones productoras de Argentina M. Landa1, A. Iribarne1, G. Ghersi1, M. Calderon1, M.T. Berbery2, O.H. von Baczko2 1 Dirección de Laboratorio Vegetal, SENASA 2 Dirección de Información Estratégica Fitosanitaria, SENASA plagas@senasa.gob.ar INTRODUCCIÓN Xylella fastidiosa es una bacteria que afecta al xilema, causando diversos síntomas como secado y escaldadura de hojas, decaimiento, debilitamiento y hasta la muerte de plantas. Existen varias subespecies y tipos genéticos, cada uno de ellos, con un rango de especies vegetales a las que puede infectar y en las que causa enfermedad. La bacteria se puede dispersar con el movimiento del material de propagación agámico o por insectos vectores de la familia Cicadellidae. En Argentina, X. fastidiosa subsp. pauca se encuentra presente en cultivos cítricos y olivo, mientras que las subespecies fastidiosa, multiplex, morus, sandyi y tashke son plagas cuarentenarias ausentes sin registros en el país. Considerando su impacto potencial y repercusiones comerciales, resulta necesario contar con información con la cual respaldar su condición en Argentina. OBJETIVOS Evaluar la condición fitosanitaria de Xylella fastidiosa en potenciales hospedantes (arándano y pecán). MATERIALES Y MÉTODOS Se implementó en la campaña 2022/2023 un sistema de monitoreo en las principales regiones productoras de Tucumán, Entre Ríos y Buenos Aires. Se tomaron 86 muestras de hojas con sintomatología compatible con la enfermedad, 47 de arándano y 39 de pecán, las cuales fueron analizadas por técnicas serológicas y confirmadas por técnicas moleculares de acuerdo al protocolo EPPO PM7/24(5). RESULTADOS Las actividades de vigilancia específica se realizaron entre la última quincena de septiembre y la primera de diciembre. Se tomaron 21 muestras de arándano en varias localidades de la provincia de Tucumán, 20 muestras correspondientes a arándano y 23 a pecán abarcando 12 localidades de la provincia de Entre Ríos y 6 muestras arándano y 16 pecán en la región norte de la provincia de Buenos Aires. Todas las muestras resultaron negativo para Xylella fastidiosa Figura 3. DAS ELISA Figura 4 Figura 1 Figura 2 Inspección de síntomas a campo y toma de muestras en arándanos (Figura 1) y en pecán (Figura 2) CONCLUSIONES Figura 5 PCR en tiempo real según EPPO PM7/24 (5) Anexo 04 (Figura 4 y 5) No se detectó la presencia de Xylella fastidiosa en la principales regiones productoras de arándano y pecán lo que refuerza la condición de ausencia de esta bacteria en los cultivos analizados. � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Evaluación de la condición fitosanitaria de<em> Xylella fastidiosa</em> en arándano y pecán en las principales regiones productoras de Argentina Creator An entity primarily responsible for making the resource Landa, M Iribarne, A Ghersi, G. Calderón, M.C Berbery, M.T Von Baczko, O.H Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Póster académico Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0181 Abstract A summary of the resource. Trabajo presentado en el 6° Congreso Argentino de Fitopatología, realizado en Cipolletti, Argentina entre los días 18 al 20 de Septiembre de 2024. Se implementó en la campaña 2022/2023 un sistema de monitoreo en las principales regiones productoras de Tucumán, Entre Ríos y Buenos Aires. El objetivo del trabajo consistió en evaluar la condición fitosanitaria de Xylella fastidiosa en potenciales hospedantes (arándano y pecán). https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/7e0b2961957a0e0332622aeffe1daab2.pdf 7dde1f404c741fcc998ad70b9e5dbb55 PDF Text Text DETECCIÓN Y DIAGNÓSTICO DEL VIRUS RUGOSO DEL TOMATE DURANTE 2023-2024 Calderón, M.C.1, Rodríguez, F.M.1, Von Baczko, O.H.2, Antenucci, M. 2, Ghersi, G.1 1Dirección de Laboratorio Vegetal, SENASA 2 Dirección de Información Estratégica Fitosanitaria, SENASA Mail: tomate@senasa.gob.ar INTRODUCCIÓN RESULTADOS El virus rugoso del tomate (ToBRFV) perteneciente al género Tobamovirus, ha sido identificado como un importante patógeno en cultivos de tomate (Solanum lycopersicum) y pimiento (Capsicum spp.), aunque también se lo ha detectado en plantas silvestres de los géneros Solanum, Taraxacum y Chenopodium. Su principal forma de transmisión es mecánica pero también puede infectar plantas contiguas a través de las micro heridas generadas por el rozamiento entre ellas y por la acción de insectos polinizadores. Por otro lado, las semillas representan la forma de diseminación más importante del virus. Los síntomas característicos se manifiestan como mosaicos y moteados con colores amarillos bien definidos en las hojas. Las láminas foliares se deforman generando ampollas o arrugas en los folíolo y eventualmente se puede encontrar estrechamientos. En cuanto a los frutos, se destacan manchas de color marrón en la epidermis y la textura es más áspera y rugosa. También pueden verse deformaciones y manchones de color correspondiente a estados de madurez anteriores (Figura 1 y 2). Todas las muestras secuenciadas por método SANGER mostaron una identidad superior al 98% con las secuencias correspondientes al aislamiento israelí (accession number KX619418). De las muestras provenientes de monitoreos se confirmaron 41 casos positivos en producciones de fruta fresca realizando las primeras detecciones en Colonia Belgrano (Entre Ríos), Luján, La Plata, Mar del Plata (Buenos Aires), Orán (Salta), Lavalle (Corrientes), Gaiman y Sarmiento (Chubut). De las 145 muestras de importación analizadas a la fecha, el 100%, resultaron negativas para la presencia de ToBRFV (Figura 4) siendo los principales países de origen de material de propagación China, Perú, India y Tailandia (Figura 5). Presencia No detectado 411 41 145 0 Muestras de monitoreo Muestras de importacion Figura 4. Resultados muestras analizadas 2023-2024 Figura 1. Síntomas en hoja Figura 2. Síntomas en fruto OBJETIVOS Figura 5. Países de origen de semillas de importación DISCUSION Y CONCLUSIONES Determinar la distribución y el alcance de la enfermedad mediante el análisis de muestras provenientes de monitoreos de zonas hortícolas y de material de propagación de importación a fin de dar respuesta ante la alerta fitosanitaria declarada (RS 569/23). En base a los resultados obtenidos fue posible determinar 3 regiones en el país: áreas de producción sin detecciones de ToBRFV (Cuyo y región central del país), áreas relevantes por su producción, con escasa prevalencia de la enfermedad (NOA y Patagonia) y áreas importantes para la producción, con elevada prevalencia de la enfermedad (NEA y Bs As). A partir de la certificación de material de propagación libre de ToBRFV se fortalecen las acciones fitosanitarias y se minimizan los riegos de propagación y avance de la enfermedad. Por otro lado, se continúan las acciones de prevención y monitoreo en todas las regiones productivas y el laboratorio de referencia del SENASA cuenta con procedimientos de PCR en tiempo real y final con los cuales da respaldo analítico a la problemática fitosanitaria del país. MATERIALES Y METODOS Durante la campaña 2023-2024 se realizaron monitoreos, a partir de los cuales se tomaron 411 muestras sospechosas de material vegetal con síntomas compatibles con la presencia del virus. Asimismo, dada la importancia de la semilla en la dispersión de la enfermedad, se validaron las metodologías de diagnóstico necesarias para la certificación en material de importación, analizando 145 muestras de tomate y pimiento (Figura 3). Todos los análisis se realizaron mediante métodos moleculares por RT-PCR en tiempo real y punto final siguiendo los lineamientos detallados en la Norma EPPO 7/146 (2). Algunas muestras positivas se analizaron mediante RT-PCR convencional según anexo 2 de la Norma y los fragmentos obtenidos de 560pb. fueron secuenciados por método SANGER. Referencias Figura 3. Distribución de análisis realizados PM 7/146 (1) Tomato brown rugose fruit virus. EPPO Bulletin, EPPO (2021). 51, 178–197. Resolución SENASA N° 569/23 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Detección y diagnóstico del virus rugoso del tomate durante 2023-2024 Creator An entity primarily responsible for making the resource Calderón, M.C Rodríguez, F.M Von Baczko, O.H Antenucci, M Ghersi, G. Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Relation A related resource Resolución SENASA N° 569/23 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Póster académico Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0180 Abstract A summary of the resource. Trabajo presentado en el 6° Congreso Argentino de Fitopatología, realizado en Cipolletti, Argentina, entre los días 18 al 20 de Septiembre de 2024. Objetivo del trabajo de investigación: Determinar la distribución y el alcance de la enfermedad mediante el análisis de muestras provenientes de monitoreos de zonas hortícolas y de material de propagación de importación a fin de dar respuesta ante la alerta fitosanitaria declarada (RS 569/23) https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/fb26a7a65bd129f583eb635161abb091.pdf 41a9b70f61b32da8b38a3c21ddd8a630 PDF Text Text Guía rápida 10 plagas para identificar Características, daños y cultivos afectados Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Dirección Nacional de Protección Vegetal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �ÍNDICE Introducción 4 Objetivo 4 Plagas priorizadas 5 Picudo rojo 5 Ficha técnica 5 Descripción biológica 5 Jopo 7 Ficha técnica 7 Descripción biológica 7 Polilla esponjosa 9 Ficha técnica 9 Descripción biológica 9 Gorgojo khapra 11 Ficha técnica 11 Descripción biológica 11 Chinche apestosa 13 Ficha técnica 13 Descripción biológica 13 Nematodo blanco de la papa y nematodo dorado de la papa 15 Ficha técnica 15 Descripción biológica 15 Caracol gigante africano 17 Ficha técnica 17 Descripción biológica 17 Marchitez del banano 19 Ficha técnica 19 Descripción biológica 19 Barrenador polífago 21 Ficha técnica 21 Descripción biológica 21 Ácaro rojo de las palmas 23 Ficha técnica 23 Descripción biológica 23 Comunicación de detecciones de plagas 25 ¿Qué es el SINAVIMO? 25 Consideraciones importantes 25 Cómo notificar 25 Contacto 26 3 �INTRODUCCIÓN El comercio internacional de productos vegetales representa para muchos países una parte clave de su economía, que favorece la producción nacional de dichos productos. En este contexto, los sistemas de vigilancia fitosanitaria y alerta temprana constituyen una herramienta fundamental para proteger los cultivos y ambientes naturales. Estos sistemas generan información sobre nuevas plagas, entendidas como cualquier especie, raza o biotipo –ya sea de hongo, bacteria, virus, viroide, animal (nematodo, insecto, arácnido, etc.) o vegetal (malezas de cualquier orden)– nociva para los vegetales y cuya presencia se detecta por primera vez en el país, en un área determinada de Argentina o en un nuevo cultivo. Esta información permite determinar el estatus fitosanitario de Argentina y sustenta la toma de decisiones en el ámbito de la protección fitosanitaria nacional y regional, contribuye a la apertura y mantenimiento de mercados de exportación, respalda el análisis de riesgo de plagas y avala las certificaciones fitosanitarias –que garantizan que los productos locales cumplen con los requisitos establecidos por otros países para ingresar en su territorio–. En Argentina, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) recopila, analiza y sistematiza toda la información disponible sobre las plagas que afectan a los cultivos del país a través del Sistema Nacional de Vigilancia y Monitoreo (Sinavimo). Objetivo La presente guía está destinada a investigadores, productores, asesores (y todas aquellas personas que estén en contacto directo con los cultivos) con el fin de que comuniquen la presencia de enfermedades o plagas que difieran de las problemáticas fitosanitarias habituales y puedan ser nuevas para el país, para la zona o para el cultivo afectado. La notificación puede hacerse en las oficinas del Senasa o en el sitio web del Sinavimo. 4 �Plagas priorizadas 1. Picudo rojo Ficha técnica • Nombre científico: Rhynchophorus ferrugineus. • Tipo: insecto. • Afecta a: palmeras. • Daño que ocasiona: caída de hojas, debilitamiento y muerte de las palmeras. • Dispersión: a través de palmeras infestadas que ingresen al país y vengan con el insecto en su interior. Descripción biológica Este insecto vive y se alimenta en el interior de las palmeras, condición que hace difícil detectar su presencia con una simple inspección visual. Tiene metamorfosis completa y además se pueden encontrar los cuatros estadios diferentes conviviendo al mismo tiempo: huevo, larva, pupa y adulto. Posee una gran capacidad reproductiva ya que precisa solo entre 3 y 4 meses para desarrollar todas las fases de su ciclo biológico (como mínimo, puede tener tres generaciones al año). Solo los adultos abandonan la palmera y lo hacen cuando esta no puede acoger a la próxima generación o no queda material vegetal interno para alimentarse. Las hembras salen con los huevos fertilizados lo que las convierte potencialmente en colonizadoras de nuevas palmeras. El adulto se dispersa dentro de un área determinada volando o caminando pero, una vez establecido en una palmera, prefiere lo segundo. El huevo es de color amarillo claro a blanquecino, cilíndrico, brillante, tiene forma ovalada y mide de 1 a 2,5 mm. Se localizan en el interior de grietas, heridas o pequeñas cámaras en forma de agujero realizadas por las hembras. Los mismos son colocados de manera solitaria o conjunta pero sin entrar en contacto unos con otros. Los huevos quedan protegidos y fijados con una secreción. Las puestas van de 300 a 400 huevos. Las larvas al principio tienen un color blanquecino que va tomando una tonalidad amarillenta oscura a medida que avanza el ciclo. Es ápoda, alargada, segmentada y con una cabeza endurecida de color rojo-marrón oscuro provista de unas fuertes mandíbulas cónicas. Al final de la fase, la larva puede llegar a tener 5 cm de longitud. El periodo larvario necesita de 1 a 3 meses para completarse. Al final del período larvario, la larva construye una envoltura en forma oval con fibras del interior de la palmera. Estos capullos tienen una longitud de 4 a 6 cm, se localizan en las bases de las hojas y en su interior se encuentra la larva-pupa. Esta fase dura de 15 a 30 días. Una vez finalizada la metamorfosis el adulto permanece en el interior unos 10 días más. 5 �El adulto puede vivir de 45 a 90 días, tiene el cuerpo oval alargado de 19 a 45 mm de longitud, de coloración variable; pardo anaranjado claro o rojo ferruginoso, con o sin manchas negras en el pronoto de forma y números variables. Rostro alargado y curvo en hembras, y en el macho recto y recubierto de un cepillo de setas mientras que en las hembras es liso. Material audiovisual 6 �2. Jopo Ficha técnica • Nombre científico: Orobanche cumana. • Tipo: maleza. • Afecta a: girasol. • Daño que ocasiona: quita de nutrientes al cultivo, peligro para la producción de semillas y granos de girasol, pérdida total de la cosecha.  • Dispersión: a través de sus semillas que pueden adherirse a múltiples superficies y contaminar semillas de girasol; también puede dispersarse por el viento. Descripción biológica Orobanche cumana o jopo es una planta angiosperma holoparásita, al entrar en contacto con la raíz del huésped, se forma un haustorio y las células intrusivas penetran a través de la corteza hasta el haz vascular para establecer conexión con el xilema del huésped, del que extrae agua y nutrientes minerales y orgánicos, pues carece de clorofila con la que realizar la fotosíntesis. O. cumana se convierte en un tubérculo en la superficie de la raíz y alcanza un diámetro de 5 a 20 mm. Las raíces secundarias pueden desarrollarse en el tubérculo y establecer contactos separados con el sistema de raíces del huésped. Después de varias semanas, el tubérculo desarrolla uno o más brotes florales que emergen del suelo. Se trata de una planta erecta de 40-65 cm formada por un tallo pubescente-glanduloso, generalmente amarillento o blanquecino, con esbozos de hojas escamiformes sin clorofila; las raíces están transformadas en haustorios para fijarse a las raíces de las plantas hospederas; una vez desarrollada, los tallos se tornan pardos o violáceos con hojas linear-lanceoladas. Las flores se agrupan en inflorescencias de 22-30 cm, laxa a veces solo densa en el ápice en espiga, con corola de 19-22 mm, de limbo blanco o azul pálido e hinchada en la base, con estigmas también blancos. Tiene segmentos del cáliz enteros, a veces bífidos.  Los ataques de jopo pueden poner en peligro la producción de semilla de girasol. Las pérdidas pueden suponer el total de la cosecha si no se siembran híbridos genéticamente resistentes a esta maleza. El ciclo de vida de O. cumana se desarrolla la mayor parte del tiempo bajo tierra. La germinación de las semillas de la planta parásita tiene lugar en presencia del girasol, pues ocurre por efecto de sustancias estimulantes segregadas por las raíces de éste. La plántula de la parásita muere si en los primeros días no encuentra y parasita a la raíz del girasol. Entre las sustancias inductoras de la germinación de la maleza se encuentran las hormonas llamadas estrigolactonas, cuya producción parece aumentar en las plantas de girasol cuando hay déficit de fósforo en el suelo. Por esto, en algunas ocasiones se asocia un déficit de fósforo en el suelo con la estimulación de la germinación de las semillas de jopo. Al emerger a la superficie O. cumana lo hace en forma de unos tallos 7 �sin hojas que darán lugar a las flores y éstas a unas minúsculas semillas. Cada individuo puede producir hasta 500.000 semillas. Las semillas son muy pequeñas de 0,2 mm de largo, y permanecen viables en el suelo hasta 20 años después de su formación, por lo que un campo infestado con jopo seguirá siendo susceptible a esta planta parásita durante un gran periodo de tiempo. De forma natural el jopo está asociado a la hierba adventicia artemisia (Artemisia spp.), en cuyas raíces también puede establecerse. Se cree que la ausencia de O. cumana en las regiones productoras de girasol de América del Sur está asociada con temperaturas invernales más cálidas que no son adecuadas para que esta especie se establezca. Las semillas se dispersan fácilmente de forma natural por el viento y el agua y pueden introducirse accidentalmente en una nueva área como contaminante de las semillas de girasol. La detección de las semillas mediante inspección visual es casi imposible. La dispersión natural de las semillas de esta maleza es a través del viento o el agua. Otra forma de dispersión es mediante vectores como el ganado, ya que las semillas sobreviven al paso del tracto digestivo del animal, después de la ingestión y a su vez pueden adherirse a las patas y al pelaje. La introducción accidental de O. cumana puede ocurrir, localmente, a través del movimiento del suelo en vehículos o a largas distancias como contaminante de otros cultivos. Material audiovisual 8 �3. Polilla esponjosa Ficha técnica • Nombre científico: Lymantria dispar. • Tipo: insecto. • Afecta a: alrededor de 300 especies de plantas, la mayoría árboles de hoja caduca, especialmente robles, álamos, hayas y castaños. • Daño que ocasiona: defoliación severa. • Dispersión: a través de embalajes, medio de transportes marítimos o contenedores ya que las polillas son atraídas por las luminarias de los puertos de los países en donde se encuentra presente y colocan sus huevos. Descripción biológica Lymantria dispar tiene una generación por año. Pasa el invierno en forma de huevo, protegido dentro de los típicos plastones amarillentos, en la corteza de los troncos u otros órganos leñosos de las plantas hospedantes. Los huevos eclosionan durante la época del rebrote de sus huéspedes en la primavera. Durante el primer estadio, las larvas (en fase espejo) permanecen encima de la puesta sin comer. Pasados diez días, las orugas –que poseen un marcado fototropismo– comienzan la fase de dispersión y se dirigen a la parte alta de la copa en donde comienza su alimentación. En los primeros tres estadios se alimenta durante la noche. Inicialmente los daños se producen sobre las hojas nuevas y consiste en pequeñas roeduras por el centro de la hoja. En esta fase, si el árbol no tiene hojas nuevas, las larvas se dejarán colgar de hilos de seda para ser dispersadas por el viento a nuevos pies con hojas rebrotadas: este es el sistema empleado para su dispersión en la polilla gitana raza europea, ya que la hembra no puede volar. Así pueden desplazarse varios kilómetros. Por ello se deduce que el viento es el principal factor de dispersión. Cuando el ataque de la plaga es muy intenso, la oruga destruye completamente las hojas y los brotes nuevos, incluso las hojas de años anteriores, causando una defoliación total. Durante toda su vida, las larvas consumen alrededor de 1m² de follaje. El tiempo de paso de un estadio a otro es de unos 10 días, aunque si las condiciones climáticas son favorables, puede reducirse a 5. Por ello la fase larvaria dura unos 2 meses, aunque podría reducirse a la mitad. Una vez completa la fase larvaria, la oruga empupa. Las orugas se reúnen en grupos pequeños en la parte inferior de las ramas bajas. Esta fase suele comenzar a principios del verano y dura entre 10 y 15 días. Pasado este tiempo emergen los adultos, que viven 5 días durante los cuales se realiza la puesta, que permanecerá en el árbol hasta las eclosiones de la siguiente primavera. Los machos eclosionan 1 o 2 días antes que las hembras y ambos sexos, cuando emergen, son sexualmente maduros. 9 �En plantas frutales se alimentan en un inicio de partes florales y continúan hasta alcanzar la plenitud de floración. En una última instancia, se alimentan de frutos y hojas en expansión a lo largo del nervio central y los laterales. Material audiovisual 10 �4. Gorgojo khapra Ficha técnica • Nombre científico: Trogoderma granarium. • Tipo: insecto. • Afecta a: productos almacenados secos, principalmente de origen vegetal. • Daño que ocasiona: contaminación de los productos. • Dispersión: a través de las larvas, pupas y huevos que contaminan los productos; otras fuentes de dispersión pueden ser contenedores o material de embalaje que haya sido utilizado para transportar productos infestados, así como también equipos utilizados en el procesamiento.  Descripción biológica El gorgojo prefiere condiciones cálidas y secas y se lo encuentra en sitios donde se almacenan o procesan granos. Las infestaciones son muy difíciles de controlar ya que este insecto posee la habilidad de sobrevivir sin alimento por períodos prolongados; prefiere ámbitos secos y alimento con bajo contenido de humedad y es resistente a numerosos insecticidas. Sus huevos son depositados de forma aislada sobre las superficies de los productos afectados. Inicialmente son de color blanco pero a medida que cumplen su desarrollo pasan a amarillo pálido. Son cilíndricos de 0,7 mm de largo y 0,25 mm de ancho. Este estadio es muy difícil de ver durante la inspección debido a su tamaño. Como larva, en el primer estadio mide 1,6 a 6 mm. Parte de la longitud corresponde a una cola larga de pelos, formada en el último segmento abdominal. El color es amarillo claro uniforme, excepto en la cabeza y las setas del cuerpo que son cafés, y a medida que la larva aumenta de tamaño, el color del cuerpo cambia a café rojizo dorado. Existen dos variaciones genéticas en las larvas: las que pueden tener una “diapausa facultativa” y las que no tienen esa capacidad. Las larvas del primer tipo son estimuladas para entrar en diapausa por las condiciones adversas, como temperaturas bajas o altas, o la falta de alimento. Durante la diapausa, su respiración disminuye hasta un nivel extraordinariamente bajo, y ello le proporciona una tolerancia a la fumigación con insecticidas o biocidas (parecen muertas). Las larvas que se encuentran en diapausa son resistentes al frío y pueden sobrevivir a temperaturas inferiores a -10 °C. Si las condiciones vuelven a ser favorables, las larvas diapáusicas despiertan de su letargo, se alimentan, hidratan, pupan y los adultos son capaces de reproducirse rápidamente, ocasionando graves daños al producto alimenticio donde se encuentren. La pupa es de tipo exarata (los apéndices se encuentran libres y son visibles todas las partes del cuerpo) y queda retenida en la última muda larvaria. El largo es entre 3,5 a 5 mm. 11 �El adulto es un pequeño escarabajo coleóptero negro parduzco, de forma oval oblongo, con la superficie del pronoto y élitros cubierta de pelos finos que le dan apariencia aterciopelada. Sus colores son café claro oscuro, negro y aun amarillo y blanco, entremezclados entre sí. La hembra es de color más claro que el macho. Un fleco de pelos café cubre la punta del abdomen. Material audiovisual 12 �5. Chinche apestosa Ficha técnica • Nombre científico: Halyomorpha halys. • Tipo: insecto. • Afecta a: especies vegetales, con una clara preferencia por frutales, hortalizas y legumbres. • Daño que ocasiona: perfora los tejidos vegetales y succiona los jugos de hojas, tallos y frutos de las plantas hospedantes, lo que puede provocar la aparición de pequeñas manchas, surcos y decoloraciones. • Dispersión: este insecto es un excelente volador, lo que le permite desplazarse con facilidad entre sus plantas hospedantes; además, su dispersión se ve facilitada accidentalmente a través del transporte de productos agrícolas, así como en vehículos, equipaje y contenedores de carga, por lo que se la considera una plaga contaminante. Descripción biológica Es un insecto muy resistente al frío, su mortalidad se incrementa en temperaturas menores a los -12 °C. Según el clima presenta 1 a 5 generaciones dependiendo del fotoperíodo. Hiberna como adulto sin actividad (dentro de construcciones, troncos, hojarasca) y se transforma en una plaga urbana. En primavera, con el aumento de las temperaturas, empieza a migrar a plantas para iniciar su alimentación. Dos semanas después comienza a aparearse y poner huevos en varias especies de plantas. Esta chinche requiere diferentes nutrientes a lo largo de su vida por lo que se mueve de hospedante en hospedante. Se alimenta de yemas, hojas, flores, frutos y troncos. Se la considera una plaga “de bordes” al moverse constantemente de especie en especie. Los durazneros son considerados como hospedantes preferido por lo que puede completar todo el ciclo en estos sin necesidad de moverse a otra especie. En general, vuelan hasta 5 km pero pueden llegar a alcanzar distancias de más de 100 km en un día y es un buen caminador. Los huevos son de forma elíptica, miden 1,6 mm x 1,3 mm, de color amarillo claro a amarillo rojizo con unas espinas diminutas que forman líneas finas. Se los encuentra fijados a la parte inferior de las hojas, en conjuntos de 20 a 30 huevos, uno al lado de otro. Las ninfas pasan por 5 estadíos variando en tamaño desde la primera etapa en la que mide 2,4 mm hasta la quinta etapa donde miden 12 mm de longitud. Los ojos son de color rojo oscuro. El abdomen es de color amarillo rojizo en 13 �la primera etapa y progresa a color blanco opaco con manchas rojizas en la quinta etapa. Las patas, cabezas y el tórax son de color negro. Tienen, además, unas púas o espinas localizadas en el fémur, ante cada ojo y varias en los márgenes laterales del tórax. Los adultos miden aproximadamente 17 mm de largo y tienen tonos de color marrón sobre las superficies superior e inferior de sus cuerpos. Al igual que otras chinches, tienen forma de escudo y casi el mismo ancho que el largo. H. halys posee unas bandas claras en las antenas y otras más oscuras en las membranas que están montadas sobre la parte trasera del par de alas frontales. Tienen depresiones pequeñas y redondas de color cobre o azul metálico sobre la cabeza y el pronotum. Material audiovisual 14 �6. Nematodo blanco de la papa y nematodo dorado de la papa Ficha técnica • Nombre científico: Globodera pallida y Globodera rostochiensis. • Tipo: nematodo. • Afecta a: papa. • Daño que ocasiona: estos nematodos penetran las raíces y disminuyen la disponibilidad de nutrientes para un adecuado desarrollo de la planta. Pueden reducir el rendimiento de los cultivos entre un 20% y un 70%. • Dispersión: por movimiento de papa semilla, plantas, suelo, herramientas, equipos y maquinaria agrícola contaminados con los quistes que pueden contener entre 300 y 500 huevos cada uno. Descripción biológica El nematodo quiste blanco de la papa es endoparásito sedentario y presenta un notable dimorfismo sexual. Al crecer, la hembra comienza a tomar forma esférica y los machos se mantienen vermiformes. Los machos son relativamente más abundantes cuando las condiciones ambientales son pobres ya que demandan menos alimento que las hembras porque no se alimentan durante el estadio de vida libre. El macho vermiforme tiene una vida corta de 10 días y durante este periodo, se aparea con tantas hembras como le sea posible. Es una especie anfimíctica (tipo de reproducción que se desarrolla cuando las poblaciones de machos son mayores a las hembras). Presenta cuatro mudas y cuatro estadios juveniles. El juvenil del segundo estadio es la forma resistente e infectiva; se encuentra dentro del quiste o en el suelo, y es el que invade la raíz. En ausencia de un hospedero, el juvenil puede permanecer en el quiste por 8 o más años. Cada quiste contiene alrededor de 500 huevos y permanece en el suelo después de la muerte del hospedador, generalmente en los 30 cm de profundidad. Los juveniles, estimulados por las exudaciones de las raíces del hospedero, salen del quiste y entran a la raíz en la zona anterior al ápice de la raíz o en la zona de las raíces laterales en formación; también penetran en los tubérculos. Los juveniles se mueven hacia la parte anterior de la raíz y comienzan a alimentarse de un grupo de células del periciclo, la corteza o endodermis, las cuales se modifican en células transfer, denominada sincitio, desde donde se desarrollan hasta la madurez sexual. El sexo está determinado por la nutrición: con suficiente alimento se forman hembras y con poco alimento, machos. La hembra adulta se engrosa, rompe los tejidos de la corteza y deja la parte posterior del cuerpo fuera de la raíz. Los machos que están dentro de la exuvia salen y encuentran a la hembra atraídos por las secreciones de esta. Después de la puesta, la hembra deja de alimentarse y muere, y su cuerpo se endurece, formando el quiste. El ciclo biológico dura alrededor de 5 a 7 semanas, dependiendo de la temperatura, humedad y otros factores, y solo se produce una generación por año. 15 �La actividad de los juveniles comienza con temperaturas de 10 °C y a 16 °C comienzan a invadir la raíz; la actividad cesa a 40 °C. Mediante estímulos de las plantas hospederas, hay una eclosión del 80 % de los huevos; en condiciones no favorables, se ha observado una eclosión espontánea anual del 20 %, dependiendo del tipo de suelo y la temperatura. La longitud del día influye en la eclosión del huevo, la cual es más rápida en donde los hospederos tienen más luz continua que horas prolongadas de oscuridad. Material audiovisual 16 �7. Caracol gigante africano Ficha técnica • Nombre científico: Lissachatina fulica. • Tipo: molusco. • Afecta a: gran variedad de cultivos. • Daño que ocasiona: además del impacto sobre la agricultura, también puede transmitir parásitos perjudiciales para las personas, a través de su baba; asimismo, compite con especies nativas de caracoles, que deben ser preservadas. • Dispersión: mediante el movimiento de plantas, tierra y otros elementos en los que se refugia o deposita sus huevos. Descripción biológica Se considera como una de las peores plagas de caracoles a nivel mundial, tanto por su efecto devastador sobre cultivos de gran variedad de especies, como por ser transmisor de parásitos peligrosos para la salud humana. Por otra parte, desde el punto de vista ecológico, su alta voracidad produce un desequilibrio ecológico de los ecosistemas, allí donde es introducido. La conchilla es de tamaño grande (hasta 20 cm de largo), oval, oblonga, de color crema con bandas radiales castañas que se desorganizan a modo de flámulas y, a veces, bandas blanco-amarillentas espirales en la parte inferior de la última vuelta; de paredes no muy gruesas, algo quebradiza, con líneas de crecimiento suaves y frecuentes cicatrices; posee 7 a 8 vueltas convexas; sin ombligo; conchilla embrionaria (protoconcha) lisa, de color blanco; interior de las vueltas de tonalidad violácea; abertura cercana a la mitad de la altura; la espira (conjunto de las vueltas a excepción de la última) en alargada, color café con marcas o bandas longitudinales oscuras e irregulares. Los juveniles son más claros con bandas amarillentas. Es una especie tropical y subtropical que vive en zonas cálidas, húmedas algo áridas. Posee una elevada capacidad de adaptación a diferentes hábitat y condiciones ambientales, por ello se lo puede encontrar en una amplia diversidad de ambientes tales como zonas boscosas naturales o antrópicas, zonas agrícolas, zonas ribereñas, matorrales, zonas urbanas y periurbanas. Es una especie de hábito nocturno y prefiere sitios húmedos y sombríos. Pasa las horas del día enterrando en la tierra. Pueden vivir de 5 a 9 años. Son hermafroditas con fecundación cruzada obligatoria. La autofecundación puede existir, pero no es lo común. Es una especie ovípara. La madurez sexual se alcanza entre los 5-15 meses de vida dependiendo de la temperatura ambiental. Durante el período de reproducción pueden realizar hasta 6 copulaciones en dos meses. Con la ayuda de la parte anterior del pie el caracol excava y construye un nido, no muy profundo, donde deposita los huevos en aglomeraciones. Oviponen en promedio 200 a 300 huevos por puesta y pueden oviponer 5 a 6 veces por año. Se estima que ponen en promedio 1200 huevos por año. 17 �Los huevos son redondos y miden de 4.5 a 5.5 mm de diámetro. Eclosionan cuando la temperatura ambiental en mayor a 15 ºC. La tasa de fertilidad disminuye progresivamente en el segundo año de vida. Material audiovisual 18 �8. Marchitez del banano Ficha técnica • Nombre científico: Fusarium oxisporum f. sp. cubense Raza 4 Tropical. • Tipo: hongo. • Afecta a: bananos y plátanos. • Daño que ocasiona: a medida que la enfermedad progresa, las hojas cuelgan y forman una falda alrededor de la parte inferior de la planta; en estados avanzados, la enfermedad puede provocar la muerte de la planta. • Dispersión: por agua de riego o lluvia, por utilización en distintas plantaciones de herramientas y maquinaria sin desinfestación y por circulación de personal entre lotes contaminados y sanos. Descripción biológica Es un hongo habitante de suelo perteneciente a la clase ascomycetes, que forma tres tipos de esporas: macroconidios, microconidios y clamidosporas. Fusarium oxysporum f.sp. cubense presenta cuatro razas. La raza 4 es la que evolucionó más recientemente y la más virulenta, e infecta a bananos tanto del grupo Cavendish (AAA) como a los cultivares susceptibles de Gros Michel (AAA) y Manzano (AAB) y Bluggoe (ABB). La raza 4 Tropical (RT4) de Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) es actualmente una de las mayores preocupaciones del cultivo de bananos y plátanos en el mundo. Tal preocupación viene dada porque la mayor parte de las variedades, incluyendo las del grupo Cavendish, son susceptibles. Esta raza ha provocado pérdidas considerables en Taiwán, Indonesia, Malasia y el norte de Australia. Fusarium oxysporum f. sp cubense es un patógeno del suelo, que ataca los haces vasculares, e impide la normal traslocación de agua y nutrientes. Todas las razas producen síntomas similares, de amarillamiento de hojas y marchitez. El primer síntoma externo de marchitez por Fusarium es el amarilleo de las hojas más viejas. A medida que la enfermedad progresa, las hojas se caen y forman una falda de hojas muertas alrededor de la parte inferior de la planta. Una vez establecido en una plantación, se propaga fácilmente y permanece viable en el suelo durante décadas. Internamente, haciendo un corte transversal del pseudotallo, se observa necrosis y taponamiento de los haces vasculares. 19 �Material audiovisual 20 �9. Barrenador polífago Ficha técnica • Nombre científico: Euwallacea fornicatus. • Tipo: insecto. • Afecta a: árboles de la familia Fagaceae (como roble y haya), plantas de la familia Lauraceae (como la palta) y otras maderas duras. • Daño que ocasiona: la hembra perfora la corteza de los árboles –especialmente en el tronco y las ramas gruesas– para depositar sus huevos, lo que debilita las ramas y las hace más vulnerables a la rotura y a la entrada de enfermedades y plagas; una vez eclosionados los huevos, los diferentes estadios de larva se alimentan dentro del mismo a través de galerías que se expanden a medida que dichas larvas crecen. • Dispersión: a través de material vegetal infestado, aunque también puede desplazarse a distancias cortas volando y alcanzar unos pocos cientos de metros al año. Descripción biológica Es un escarabajo polífago originario del sudeste de Asia, las hembras son de color marrón oscuro o negro, miden entre 2,2 a 2,5 mm de largo. Los machos son de color marrón y aproximadamente de 1,5 mm de largo. El ciclo completo se desarrolla en 4 fases: huevo, larva, pupa y adulto. Su longevidad es de aproximadamente 42 días. Los huevos permanecen en grupos dentro de las galerías de las ramas, son blancos y de forma ovalada, mide 0,23 mm de largo y tardan de 7 a 8 días en eclosionar. Las larvas del primer estadio son blancas y se alimentan dentro de las galerías; miden 0,92 mm de largo por 0,37 de ancho y permanecen en este estado larvario 5,5 días. Las de segundo estadio también son de color blanco, se alimenta dentro de la galería y miden de 1,30 por 0,44 mm y el periodo de desarrollo es de 6,8 días. Las del tercer estadio son más transparentes, ligeramente amarillentas y la cabeza alcanza mayores dimensiones, mide 1,80 mm de longitud por 0,60 mm y el periodo de desarrollo es de 6 días. Las larvas pupan dentro de las galerías de pequeñas ramas. Las pupas son de color marrón amarillento y miden 1,97 por 0,97 mm. El periodo de permanencia en estado de pupa es de 10 días. Los agujeros del escarabajo penetran de 1 a 4 cm en la madera, de forma recta. Con frecuencia hay muchos agujeros de salida en un árbol infestado. El daño producido conduce al debilitamiento de dichas ramas y su rotura, favoreciendo puntos de entrada de enfermedades u otras plagas. Esta plaga puede viajar en cortas distancias volando. Su principal medio de dispersión es el material vegetal infestado. 21 �Material audiovisual 22 �10. Ácaro rojo de las palmas Ficha técnica • Nombre científico: Raoiella indica. • Tipo: ácaro. • Afecta a: palmeras, plátanos y bananos. • Daño que ocasiona: manchas amarillas y muerte del tejido vegetal afectado. • Dispersión: se dispersa a través del viento, por el traslado de plantas infestadas y por personas que estuvieron en contacto con material infestado. Descripción biológica Es un ácaro de coloración rojiza de forma oval y aplanada. Se caracteriza por la presencia de setas alargadas en forma de espátulas en el dorso. Los machos se distinguen de las hembras por la parte terminal del abdomen en forma triangular a diferencia de la hembra que es redondo. Las hembras adultas miden, aproximadamente, 0,29 a 0,30 mm, incluyendo los palpos, en cambio los machos miden 0,21mm. Todos los estadios son rojizos, sin embargo las hembras adultas presentan áreas oscuras en el abdomen. Los niveles poblacionales de están influenciados fundamentalmente por la humedad relativa, las temperaturas y el fotoperiodo. Normalmente, el ciclo de vida de huevo a adulto requiere 23 a 28 días para las hembras y 20 a 22 días para los machos. Los ácaros pueden estar presentes por varias semanas antes de que los síntomas sean visibles. Se encuentran alimentándose en grupos sobre la superficie del tercio inferior de las hojas, apareciendo puntuaciones amarillas que confluyen formando una mancha de mayor tamaño. Son fácilmente observables sobre las hojas verdes pero también se los puede ver en las frutas y otras partes de la planta. Las plantas jóvenes son las más atacadas y los daños más evidentes son en las hojas viejas que se tornan de color amarillo y pueden llegar a secarse completamente. Al color amarillo de las hojas, le sigue el aborto de las flores y la disminución del tamaño de las copas. El daño causado por el proceso de alimentación en los dos lados de la nervadura del foliolo hace que este se doble, mientras los ácaros permanecen protegidos en el interior del foliolo doblado. Los niveles poblacionales de Raoiella indica están influenciados fundamentalmente por la humedad relativa, las temperaturas y el fotoperiodo. Las condiciones óptimas de temperatura para el desarrollo son de 24.2 ºC en verano y 17.9 ºC en invierno, como así también baja humedad relativa y fotoperiodos largos. 23 �Material audiovisual 24 �Comunicación de detecciones de plagas ¿Qué es el SINAVIMO? El Sistema Nacional de Vigilancia y Monitoreo de plagas (SINAVIMO) es una de las principales herramientas de la Dirección de Información Estratégica Fitosanitaria (DIEF), perteneciente al Senasa. Es el portal oficial de información fitosanitaria de la República Argentina y contribuye a los principios de transparencia y cooperación internacional establecidos por la Convención Internacional de Protección Fitosanitaria (CIPF). El SINAVIMO permite recolectar, sistematizar y proveer información respecto a la condición (presencia o ausencia) de las plagas y su relación con los principales cultivos y productos vegetales en el territorio nacional. Sus contenidos son respaldados por una red de expertos vinculados a la protección fitosanitaria y son actualizados permanentemente por los agentes de la DIEF, lo cual resulta en el SINAVIMO como una herramienta dinámica y eficaz que permite sustentar las declaraciones de Argentina en el marco de las negociaciones internacionales y brindar apoyo para la toma de decisiones. La información disponible es de acceso libre y gratuito y puede visualizarse desde cualquier parte del mundo a través del sitio web www.sinavimo.gob.ar. Consideraciones importantes La Resolución Senasa 778/2004 establece que todo organismo de investigación, privado u oficial, vinculado al área fitosanitaria en el territorio argentino, debe comunicar al Sinavimo la detección o caracterización de nuevas plagas de vegetales (tanto cuarentenarias como no cuarentenarias) a través del formulario de comunicación de primeras detecciones y antes de divulgar el hallazgo por cualquier medio. Es importante destacar que la comunicación de una detección no impide la publicación de la investigación o el reconocimiento de la autoría del descubrimiento. La información recibida es de carácter confidencial hasta tanto sea publicada por su autor. Una vez analizada, el Senasa puede requerir más detalles si es necesario. Cómo notificar Para consultas sobre plagas, escribir al correo electrónico de la Dirección de Información Estratégica Fitosanitaria, dief@senasa.gob.ar.  Para notificaciones, completar el formulario del sitio web del Sistema Nacional de Vigilancia y Monitoreo de plagas (SINAVIMO). Según la evaluación del caso, puede ser necesario que personal del Senasa tome una muestra para su identificación en laboratorio. 25 �Contacto Dirección de Información Estratégica Fitosanitaria Correo electrónico: dief@senasa.gob.ar Teléfono: (011) 4121-6672 26 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Guía rápida. 10 plagas para identificar. Características, daños y cultivos afectados Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección Nacional de Protección Vegetal Coordinación General de Comunicación Institucional Relation A related resource Resolución Senasa 778/2004 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0179 Abstract A summary of the resource. Contiene fichas técnicas y descripción biológica de 10 plagas que afectan diversos cultivos, para facilitar su identificación. Destinada a investigadores, productores, asesores (y todas aquellas personas que estén en contacto directo con los cultivos) con el fin de que comuniquen la presencia de enfermedades o plagas que difieran de las problemáticas fitosanitarias habituales y puedan ser nuevas para el país, para la zona o para el cultivo afectado. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivo Plagas priorizadas Picudo rojo Jopo Polilla esponjosa Gorgojo khapra Chinche apestosa Nematodo blanco de la papa y nematodo dorado de la papa Caracol gigante africano Marchitez del banano Barrenador polífago Ácaro rojo de las palmas Comunicación de detecciones de plagas ¿Qué es el SINAVIMO? Consideraciones importantes Cómo notificar Contacto Control de Plagas https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/0e11340a637b06c3ae1f958a0f7cecd4.pdf 4f6f5b8500a167e9d91b10c236c244cb PDF Text Text TESIS PARA ACCEDER AL TÍTULO DE MAGISTER EN INVESTIGACION EN CIENCIAS DE LA SALUD _________________________________________________________________________ Título: ANALISIS PARASITOLOGICO DE IMPORTANCIA SANITARIA EN LOS CARACOLES GIGANTES AFRICANOS (Lissachatina Fulica) EN MISIONES Autor: M.V. Emiliano Reinante Directora de tesis: Dra. TEIBLER, Pamela Co-Directores: M.V. ALVAREZ, Darío; Mgter. VIZCAYCHIPI, Katherina A. Año: 2019 �Dedico esta tesis a Victoria y Alma AGRADECIMIENTOS: Al Director de la Regional COR-MIS (Corrientes Misiones), del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA): Ing. Agr. Pedro Méndez; al Coordinador de Protección Vegetal (P.V.): Ing. Agr. Carlos Benzo; al Ing. Agr. Enrique Giménez, de la Oficina Local de P.V. de la localidad de Puerto Iguazú, Misiones. Al Coordinador de Inocuidad y Calidad Agroalimentaria: Dr. Marcelo Gorgo. Al personal SENASA destacado en los Puestos de barreras zoofitosanitarias de la provincia de Misiones. A la Facultad de Ciencias Veterinaria de la “Universidad Nacional del Nordeste” (UNNE). Ciudad de Corrientes. A la Facultad de Veterinaria de la “Universidad del Salvador” (USAL), Campus “S.R.G.S.C.” Gdor. Ing. V. Virasoro, Corrientes. 2 �COMO RESULTADO DE ESTE TRABAJO SE REALIZARON LAS SIGUIENTES PRESENTACIONES A CONGRESOS Y PUBLICACIONES:  Sesión Científica, poster en: XVIII Sesiones de Comunicaciones Técnicas y Científicas Estudiantiles - Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE (17 de octubre de 2019, Corrientes, Argentina). Titulo: Caracol gigante africano (Lissachatina fúlica) de Misiones, identificación morfológica y análisis de materia fecal. Autores: Saldivar S; Buyatti M; Acosta F; Reinante E; Álvarez D.  Sesión Científica, ponencia oral y poster en: I Congreso de Ciencias de La Salud (22 al 23 de noviembre de 2019, Universidad Autónoma de Encarnación (UNAE), Encarnación, Paraguay). Titulo: Caracol gigante africano – Lissachatina fúlica – Identificación morfológica y Análisis parasitológico. Misiones, Argentina. Autores: Reinante E; Álvarez D; Teibler P; Vizcaychipi K. (Ver ANEXO I a y b). 3 �RESUMEN El caracol Gigante Africano, Lissachatina fulica, está incluido en la lista de las 100 especies exóticas invasoras más dañinas del mundo, fue reportado por primera vez en Argentina en la ciudad de Puerto Iguazú, provincia de Misiones, Argentina (2010), más tarde, en la ciudad de Corrientes Capital (2013) y en el año 2019 fue detectado en dos localidades más de la provincia de Misiones (Wanda y Eldorado). Esta especie de caracol siendo hermafrodita, crece y se reproduce a gran velocidad, presentando una alta resistencia a variables ambientales, adaptabilidad a diferentes regiones, dieta polífaga y la ausencia o desconocimiento de depredadores naturales contribuyen a su dispersión, pudiendo producir daños importantes en cultivos agrícolas, hortícolas y ecosistemas nativos, como también, actuar de transmisor de parásitos que puedan afectar a la Salud Pública. El siguiente trabajo se realizó en los períodos comprendidos entre los meses de diciembre de 2018 y diciembre de 2019, donde se procedió a la identificación morfológica y recolección de las conchillas de moluscos de la especie Lissachatina fúlica y su materia fecal, para su posterior análisis parasitológico. Todos los moluscos fueron recolectados de la localidad de Puerto Iguazú, con el objetivo de detectar parásitos de implicancia sanitaria (médica y veterinaria). De un total de 201 moluscos se identificaron por género y especie tres grupos: Grupo 1 (G1): Lissachatina fulica n=199; Grupo 2: Helix aspera n:1 y Grupo 3: Bulimus sp. n:1. A todos los individuos del G1 se los clasifico según categorías de tamaños definidas como: Clase 1: individuos recién eclosionados (hasta 10 mm) n= 6; Clase 2: juveniles (10 a 40mm) n=149; Clase 3: adultos jóvenes (40 a 70 mm) n=35 y Clase 4: adultos (> 70 mm) n= 9. Del análisis parasitológico efectuado a los pooles de materia fecal de L. fulica, se encontraron taxones parasitarios predominando larvas del orden Strongylida y larvas de vida libre sin especificar, como también se observaron huevos de nematodes del genero Ancylostoma spp.. Se observaron protozoos correspondientes a quistes de Ameba 4 �spp.; Giardia spp. y ooquistes de Cystoisospora spp. Por su parte en el análisis de baba de 9 ejemplares adultos de L. fulicas se encontraron taxones parasitarios del Orden Strongylidamy del Orden Ascaridea Familia Toxocaridae compatibles con el genero Toxocara spp. En muestras de baba se observaron también cristales de oxalato de calcio. Por otra parte, en 11 (once) localidades fronterizas de la provincia Misiones, se realizaron 92 encuestas, con el fin de evaluar el grado de conocimiento de la población, donde se constató un desconocimiento de la problemática en un 67,4% de los casos encuestados. Teniendo en cuanto que los factores antrópicos son la principal causa de los saltos de dispersión de esta especie, es fundamental realizar trabajos de educación sanitaria para concientizar y prevenir futuras invasiones que conlleven a perjuicios sanitarios, al ecosistema y a la agricultura. En ese contexto, a cada encuestado se entregó material informativo y las recomendaciones brindadas por el parte del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina. Palabras claves: Caracol Gigante Africano – Morfología – Parasitología – Prevención – Vigilancia. 5 �SUMMARY The African Giant snail, Lissachatina fulica, is included in the list of the 100 most harmful invasive exotic species in the world, it was first reported in Argentina in the city of Puerto Iguazú, Misiones province, Argentina (2010), later, in the city of Corrientes Capital (2013) and in 2019 it was detected in two more locations in the province of Misiones (Wanda and Eldorado). This species of snail, being hermaphrodite, grows and reproduces at high speed, presenting high resistance to environmental variables, adaptability to different regions, polyphagous diet, and the absence or lack of knowledge of natural predators that contribute to its dispersion, potentially causing significant damage to agricultural crops, horticultural and native ecosystems, as well as acting as a transmitter of parasites that may affect Public Health. The following work was carried out in the periods between the months of December 2018 and December 2019, where the morphological identification and collection of the mollusk shells of the Lissachatina fulica species and their fecal matter were carried out, for subsequent parasitological analysis. All the molluscs were collected from the town of Puerto Iguazú, with the aim of detecting parasites of sanitary implication (medical and veterinary). From a total of 201 mollusks, three groups were identified by genus and species: Group 1 (G1): Lissachatina fulica n = 199; Group 2: Helix aspera n: 1 and Group 3: Bulimus sp. n: 1. All G1 individuals were classified according to size categories defined as: Class 1: newly hatched individuals (up to 10 mm) n = 6; Class 2: juveniles (10 to 40mm) n = 149; Class 3: young adults (40 to 70 mm) n = 35 and Class 4: adults (> 70 mm) n = 9. From the parasitological analysis carried out on the L. fulica stool poles, parasitic taxa were found, predominantly larvae of the Strongylida order and unspecified free-living larvae, as well as eggs of nematodes of the genus Ancylostoma spp. were observed. Protozoa corresponding to Ameba spp cysts were observed; Giardia spp. and oocysts of Cystoisospora spp. On the other hand, in the analysis of slime of 9 adult specimens of L. fulicas, parasitic taxa of the 6 �Order Strongylidamy of the Order Ascaridea Family Toxocaridae compatible with the genus Toxocara spp. Calcium oxalate crystals were also observed in slime samples. On the other hand, in 11 (eleven) border towns of the Misiones province, 92 surveys were conducted, in order to assess the degree of knowledge of the population, where a lack of knowledge of the problem was found in 67.4% of the surveyed cases. Considering that anthropogenic factors are the main cause of the dispersal jumps of this species, it is essential to carry out health education work to raise awareness and prevent future invasions that lead to health damage, to the ecosystem and to agriculture. In this context, informative material and the recommendations provided by the National Service of Agrifood Health and Quality of Argentina were delivered to each respondent. Keywords: African Giant Snail - Morphology - Parasitology - Prevention - Surveillance. 7 �ÍNDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN 9 1.1. Presentación. Especies Exóticas Invasoras 9 1.2. Caracol Gigante Africano. Presentación 11 1.2.1. Biología y distribución geográfica 11 1.2.2. Aspecto ambiental/biodiversidad 14 1.2.3. Aspecto socioeconómico 16 1.2.4. Aspectos sanitarios. (Médico y veterinario) 17 2. JUSTIFICACIÓN 21 2.1 Implicancias de Caracol Gigante Africano 21 2.2 Planteamiento del Problema 22 2.3 Preguntas de Investigación 22 3. OBJETIVOS (Gral. y específicos) 23 3.1 Alcance e Hipótesis 23 4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 24 5. MARCO METODOLÓGICO 28 6. RESULTADOS 38 6.1 Estudio de situación, Provincia de Misiones 38 6.2 Análisis morfológico de los moluscos 41 6.3 Estudios parasitológicos 41 6.4 Evaluaciones cualitativas. Conocimiento del Caracol Gigante Africano (L. fulica) por parte de la población de Misiones 43 7. DISCUSION Y CONCLUSIONES 46 8. COMENTARIO FINAL 49 9. BIBLIOGRAFÍA (Citada y consultada) 50 10. ANEXOS 58 8 �1. INTRODUCCIÓN 1.1. Presentación. Especies Exóticas Invasoras Las especies exóticas invasoras (EEI) son animales, plantas o microorganismos transportados más allá de sus áreas de distribución natural que, una vez introducidos, consiguen establecer en el nuevo ambiente poblaciones autosostenibles y avanzar sin ayuda humana directa sobre ambientes con distinto grado de transformación, incluyendo con frecuencia áreas de alto valor para la conservación y la producción. A nivel global son reconocidas como la segunda causa más importante de pérdida de diversidad biológica, sólo precedida por la destrucción de los ambientes naturales. Muchas de ellas son responsables, asimismo, de daños económicos significativos, comportándose como plagas de cultivos, patógenos y parásitos de animales domésticos o competidores de especies de alto valor forrajero. Su introducción con frecuencia resulta también en efectos negativos directos o indirectos sobre la salud Pública. En Argentina los ejemplos de EEI con impactos severos sobre valores ambientales y socio económicos incluyen especies tan diversas como el castor que amenaza los bosques de Tierra del Fuego, los tamariscos que reducen el agua freática en regiones áridas del país, el alga didymo que afecta el valor turístico de los ríos patagónicos y el mosquito transmisor del dengue que amenaza la salud de miles de personas. Las actuales tendencias de globalización del comercio internacional y las consecuencias del cambio climático permiten prever que el problema de las invasiones biológicas aumente (Fisher et al., 2010). Según datos del Sistema Nacional de Información sobre Especies Exóticas Invasoras, existen en el país un total de 654 EEI de plantas, animales, vertebrados, invertebrados, algas y hongos. Organización de las Naciones Unidas para la alimentación y la agricultura (FAO). Recuperado de: www.argentina.gob.ar/ambiente/biodiversidad/exoticasinvasoras (2019). De esta manera, Achatina (Lissachatina) fúlica, (Bodwich, 1822), un gasterópodo terrestre originario del África oriental, en adelante el “Caracol Gigante Africano” (CGA), es 9 �considerado como una de las plagas más perjudiciales (Floyd et al., 2005), formando parte de las 100 EEI más importantes del mundo según la Unión Internacional para la conservación de la Naturaleza. Según Fisher et. al. (2010), el CGA fue introducido a la República Federativa del Brasil de manera intencional y con fines comerciales en el año 1988, a una feria agropecuaria realizada en Curitiba, estado de Paraná y con el objetivo de remplazar al escargot verdadero (Helix aspersa), al no prosperar la producción por falta de mercado, los moluscos fueron abandonados y liberados en distintos ambientes para que luego y gracias a sus características biológicas, el CGA logre en poco tiempo colonizar exitosamente los ecosistemas urbanos y rurales, con un relativo impacto negativo en la flora y fauna nativas y a nivel socioeconómico a menor escala (Virgillito et al., 2015). Uno de los principales intereses en Lissachatina fulica es su implicancia en la salud (Acha & Szyfres, 2003), ya que puede actuar como un hospedador intermediario de Metastrongylidae, nematodos de importancia médica y veterinaria. En la actualidad, el CGA se encuentra oficialmente en cuatro localidades Argentinas, tres de la Provincia de Misiones y la cuarta en la ciudad capital de la provincia de Corrientes. Según el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina, de aquí en adelante: SENASA, a través de su Dirección de Vigilancia y Monitoreo de Plagas, dependiente de Dirección Nacional de Protección Vegetal, de aquí en adelante: DNPV, y de la Coordinación de Protección Vegetal (CRPV) -Regional COR-MIS. (Ver Planteamiento del Problema). 10 �1.2. CARACOL GIGANTE AFRICANO. PRESENTACIÓN 1.2.1 Biología y distribución geográfica El gasterópodo terrestre Lissachatina fulica perteneciente al Phylum Mollusca presenta la siguiente clasificación taxonómica: Clasificación Taxonómica: Phylum: Mollusca Clase: Gastropoda Subclase: Pulmonata Orden: Stylommatophora Familia: Achatinidae Género: Achatina Especie: Lissachatina Fulica Nombres comunes: Español: caracol gigante africano. Ingles: giant African snail, giant African land snail, kalutara snail. El CGA en su aspecto morfológico posee una conchilla cónico ovalada pudiendo medir unos 7,5 a 12cm y en casos excepcionales hasta 20cm de largo, con un diámetro de 6cm, pudiendo pesar hasta 600 gramos. Los adultos tienen color castaño claro, con bandas longitudinales anchas castaño oscuras. Los juveniles recién eclosionados y hasta los 4cm poseen una conchilla más clara y solo la mitad de la última vuelta tiene bandas longitudinales más oscuras, aunque más finas que en los adultos. Su abertura, tanto de juveniles como adultos, no es continua y se ve interrumpida por un pliegue o truncamiento de su eje interno o base de la columela (columna) (Fisher et. al., 2010) (Ver ANEXO II). Siendo hermafrodita simultáneo: cada individuo puede producir tanto esperma como óvulos, lo que posibilita la fecundación recíproca pero no puede auto fecundarse, 11 �hacen su puesta de 400 a 500 huevos cada dos meses, pudiendo llegar hasta los 1800 huevos al año, con una viabilidad del 85 a 95% (prácticamente todos eclosionan). Sus huevos miden unos 0,5cm son de color blanco y los entierra hasta 15cm bajo la superficie o los deposita entre las rocas, eclosionando en unas pocas horas hasta los 17 días Dependiendo de las condiciones climáticas, puede alcanzar la madurez sexual alrededor de 5 a 15 meses. Viven hasta 9 años, con 5 o 6 de promedio (Raut & Barker, 2002). Figura 1: Ciclo de vida de Lissachatina fúlica. (Adaptado de www.agrocalidad.gob.ec) 12 �Aunque son especies de zonas cálidas y algo áridas de clima tropical y subtropical, puede adaptarse a cualquier tipo de hábitat, desde las zonas intervenidas hasta los pantanos y zonas urbanas, donde exista vegetación, También, prefiere los ambientes que son ricos en carbonato de calcio, tales como piedra caliza, áreas con cemento u hormigón, incluso tienen el habito de ramonear paredes o conchillas de otros caracoles para obtener calcio (Gutiérrez Gregoric, 2011). Son omnívoros – Polífagos (herbívoros, necrófagos y carnívoro) pero se alimentan sobre todo de materia vegetal y pueden desarrollar la coprofagia (Salomón et. al., 2013), de gran voracidad y presentando hábitos de alimentación nocturna. Ésta especie prefiere sitios no expuestos directamente a la luz solar, con alta humedad ambiental (70%) y temperatura entre los 18 y 20°C. Sobreviven a condiciones adversas enterrándose y cubriendo el caparazón con una membrana o tapón mucoso semipermeable denominado epifragma, que disminuye la pérdida de agua permitiendo superar los períodos de sequía mediante un proceso de estivación, durante el que el animal permanece en el interior de la concha con metabolismo ralentizado e impidiendo el ingreso de posibles depredadores. Características biológicas que en conjunto, contribuyen a que el CGA sea una especie invasora exitosa. Estos caracoles son originarios de la costa africana oriental, en particular SubSahara (Raut & Barker, 2002). En países del continente africano se lo conoce bajo el nombre de “lambí”. La dispersión del CGA alrededor del mundo comenzó a principios del siglo XIX expandiéndose hacia la Costa Este de África, posteriormente a Madagascar, Mauritius y Seychelles. Este molusco ingresó a la India en 1847, expandiéndose luego a casi todo el continente asiático, llegando a Taiwán, Malasia, Japón, Sumatra y Filipinas a fines de 1930 (Valente, 2017). La introducción del CGA en el continente americano se inició en Hawai, en 1939, por una pobladora que provenía de Japón. Expandiéndose luego al continente americano, registrado en Florida (EEUU), a inicios de la década del 70 (Virgillito et. al 2015). 13 �A fines de 1988 se estableció en la Isla Martinica, para luego introducirse en Barbados y Santa Lucia (islas del Caribe). En Sudamérica, existen antecedentes de su presencia en Ecuador (Correoso Rodríguez, 2006), Colombia (De La Ossa-Lacayo et al., 2012), Venezuela, Paraguay (Secretaria del Ambiente Paraguay, S/F), el Perú (Borrero et al., 2009), en la República Federativa del Brasil se encuentra ampliamente distribuido, estando extendido en al menos 24 de los 26 estados brasileños (Maldonado Junior et al., 2010). 1.2.2 Aspecto ambiental/biodiversidad Los costos para el medio ambiente pueden incluir herbivoría; cambios físicos/químicos en agua y suelo por alteración en el ciclo de nutrientes asociado con grandes volúmenes de material vegetal que pasan a través del intestino de L. Fulica (Raut & Barker, 2002), como también por sus cuerpos en descomposición y por el carbonato de calcio de sus conchas que neutraliza los suelos ácidos, alterando las propiedades del mismo y los tipos de plantas que pueden crecer en el suelo (Mead, 1961). Otro punto importante es por desplazamiento de poblaciones de moluscos nativos por competencia (Correoso, 2006). Los caracoles gigantes africanos son competidores de hábitat y alimento, contribuyendo a una disminución en la biodiversidad y a un desequilibrio en el ecosistema (Beltramino et al., 2015). Su comportamiento voraz, gran capacidad reproductiva, el crecimiento acelerado y su resistencia a las condiciones ambientales desfavorables, les otorgan ventajas respecto a los caracoles indígenas. Aunque L. fulica es principalmente vegetariana, hay evidencia de que también puede actuar como un depredador de otros caracoles (Meyer et al., 2008). Es probable que, debido a los altos requerimiento de calcio en la dieta del CGA, éste se alimente del caparazón de otros caracoles. También pueden ocurrir efectos adversos indirectos sobre los gasterópodos autóctonos que pueden surgir a través del control del caracol (por ejemplo: uso indebido de 14 �molusquicidas) o a la destrucción de especies nativas como el Megalobulimus por desconocimiento. Figura 2: Conchilla de ejemplares adultos de Megalobulimus sp. (izquierda) y del CGA. Extraído de Gutiérrez G. & col. “Un gigante africano invade la Argentina” Artículo Vol. 22 número 129. p42. Facultad de Ciencias Naturales y Museo (UNLP). El CGA ha causado la extinción o declinación de especies de caracoles terrestres endémicos en islas (Cowie 1968; Holland et al., 2012). Aunque, es importante resaltar que muchas de las invasiones que han causado los mayores impactos tanto económicos como medioambientales fueron intencionales y planificadas. […]El caracol depredador de América Central, Euglandina rosea, por ejemplo, liberado en muchas islas del Pacífico para 15 �controlar al CGA ha causado la extinción de al menos treinta especies y subespecies endémicas de caracol en esas islas” (Wittenberg & Cock 2001). 1.2.3 Aspecto socioeconómico En la agricultura tropical el costo causado por el CGA es cuatro veces mayor. Primero está la pérdida del rendimiento del cultivo causada por la herbivoría la cual no sucede a gran escala. En varios países éste molusco es considerado una plaga de importancia agrícola, ya que posee una dieta polífaga (Albuquerque et al., 2008). Al no presentar preferencia sobre ningún cultivo en particular es capaz de alimentarse de más de doscientas especies vegetales, varias de éstas cultivables. (Raut & Barker, 2002), aunque si se conocen las plantas con mayor probabilidad de daño, que son las cucurbitáceas y las leguminosas (Mead, 1961). Nuestro país tiene una gran diversidad de especies cultivables y muchas de ellas son citadas en las bibliografías internacionales como hospedadores de ésta plaga, por ejemplo: el maíz (Zea mays), los cítricos (Citrus spp.), la soja (Glycine max) y numerosas hortícolas cómo la lechuga (Lactuca sativa), acelga (Beta vulgaris), entre otras (Virgillito, 2015). En segundo lugar, el daño puede ser causado por la propagación de enfermedades de plantas. L. fulica puede distribuir en sus heces esporas del hongo oomiceto Phytophthora palmivora (Raut & Barker, 2002). En tercer lugar, está el costo asociado con el control de la plaga. La erradicación de estos organismos es costosa (Mead 1961; Raut & Barker, 2002), los cuales pueden variar desde USD 60.000 dólares para un procedimiento de 7 meses, hasta más de USD 700.000 a un millón de dólares, utilizados para la erradicación en el estado de Florida. Simberloff 1996 en, Impacts of Introduced Species in the United States, Consequences 2(2), 13-23, 1996 / (Cap. V, p. 184) “Especies exóticas Invasoras: Una guía sobre las mejores prácticas de prevención y gestión”, estimo que en el mismo estado que de no ser controlado, el caracol gigante africano habría causado una pérdida anual de USD 11 millones en 1969 (USD 1982). 16 �En India alcanzó un grave estado de plaga, particularmente en 1946/1947, cuando apareció en proporciones epidémicas en Orissa y causó graves daños a los cultivos de hortalizas y arrozales (Pallewatta et al., 2002). Finalmente, hay oportunidades perdidas con los cambios forzosos en la práctica agrícola, como limitar los cultivos en una región a aquellos resistentes a la infestación de caracoles (Raut & Barker, 2002), como también, costos por traslado de tierra o arena provenientes de zonas seguras, como sucedió recientemente en el Parque Nacional de Iguazú, provincia de Misiones, donde las autoridades solicitaron la certificación de la arena que ingresaría para obras de cableado subterráneo a realizarse dentro de la Reserva Natural, la cual fue enviada desde 240 Km al Sur de Puerto Iguazú (Localidad de San Ignacio, Misiones), siendo la carga precintada y certificada en origen como libre del molusco, por funcionarios de la Dirección Nacional de Protección vegetal de la Regional COR-MIS, dependiente del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Ver ANEXO III). El caracol gigante africano en busca de fuentes de calcio ramonea paredes de yeso, piedras calizas por lo que se considera que impacta negativamente en la infraestructura (de la Ossa-Lacayo et al., 2012). 1.2.4. Aspectos sanitarios. (Médico y veterinario) El siguiente punto trata de las distintas implicancias sanitarias de L. fúlica, el cual puede actuar como hospedador intermediario en el ciclo de vida de dos nematodos perjudiciales para la salud humana: Angyostrongylus cantonensis (Chen, 1935,) y Angyostrongylus costaricensis (Morera & Céspedes, 1971). El primero es causante de la meningoencefalitis eosinofílica, y el segundo, agente causal de angiostrongilosis abdominal, una enfermedad que se extiende desde el sur de Estados Unidos hasta el norte de Argentina. (Oliveira et al., 2010). 17 �La familia Metastrongyloidea, en su mayoría, son parásitos pulmonares de mamíferos (hospedadores definitivos) y los gasterópodos son sus hospedadores intermediarios con muy pocas excepciones. Los adultos de Angyostrongylus cantonensis se localiza generalmente en las arterias pulmonares de las ratas (Rattus rattus y Rattus norvegicus), que actúan como hospederos definitivos y es la causa más frecuente de meningoencefalitis eosinofílica en el hombre (Alicata, 1991). Los adultos de Angyostrongylus costaricensis se localizan generalmente en las arterias mesentéricas. Las hembras eliminan huevos que eclosionan y producen juveniles de primer estadio (J1) en las ramas terminales de las arterias pulmonares, migran a la faringe, son deglutidas y eliminadas en las heces. En el exterior, los (J1) invaden un hospedador intermediario (caracoles o babosas) en el cual, en un período aproximado de dos semanas, sufren dos mudas hasta convertirse en juveniles de tercer estadio (J3) que resultan infectivos para los hospederos definitivos (mamíferos). Cuando los hospedadores definitivos ingieren el molusco o sus secreciones infectantes, los juveniles (J3) migran al cerebro donde sufren dos mudas larvarias más hasta llegar a convertirse en juveniles de quinto estadio (J5) o adultos jóvenes, lo que ocurre aproximadamente en cuatro semanas. Estos adultos jóvenes regresan al sistema venoso para llegar a las arterias pulmonares, donde, después de otras dos semanas, alcanzan la madurez sexual y pueden empezar a depositar huevos (Anderson, 2000) (Ver ANEXO IV). Según Dorta-Contreras et al. (2007) existen varias especies de animales que pueden actuar como hospedadores paraténicos o de transporte (ranas, camarones de agua dulce, cangrejos), ya que al ingerir caracoles o babosas infectados transportan los J3. Luego estos hospedadores paraténicos pueden ser ingeridos por un hospedador definitivo cerrando el ciclo del parásito. Los humanos, al igual que otros mamíferos, pueden comportarse como hospedadores definitivos accidentales al adquirir la infestación por la ingestión de caracoles o babosas crudas, con las secreciones de moluscos u otros animales (hospedadores paratenicos). Las 18 �personas generalmente se infectan al comer alimentos crudos o poco cocidos, contaminados con las larvas de A. cantonensis y A. costaricensis, o cuando manipulan huéspedes intermedios para la pesca (Ping-Wang et al., 2008; Romero-Alegría et al., 2014). La migración parasitaria en humanos se detiene en el cerebro y más raramente en los pulmones, donde los nematodes mueren, por lo cual el ciclo nunca termina de completarse. Los síntomas de éstas enfermedades pueden ser confundidos con una meningitis en el caso de Angyostrongylus cantonensis, causando Meningitis de tipo eosinofílica, (inducida por la respuesta de los eosinofios hacia los J3), cursando con fiebre, parestesia, vómitos, cefaleas, convulsiones, rigidez de nuca, aumento de la presión intracraneal y parálisis facial. También se conoce una forma Pulmonar y Ocular. Según Salomón et. al (2013): La dispersión global de A. cantonensis se encuentra asociada a la rápida propagación de L. fúlica. Varios casos clínicos de meningoencefalitis eosinofílica causada por éste nematodo fueron registrados en América del Norte, Centroamérica y América del Sur, muchos de los cuales llegaron a causar la Muerte. En el caso del Angyostrongylus costaricensis podrían confundirse con una peritonitis con dolor localizado en la fosa ilíaca y/o flanco derecho, cursando con vómitos, anorexia, diarreas y sangrado intestinal, pudiendo existir tanto perforación intestinal como oclusión, entre otros. (Acha & Szyfres, 2003). Por lo que, la capacidad del CGA de proliferar en ambientes urbanos (sinantropismo) y sus características polifágicas como la coprofagia, nos alerta frente al posible potencial epidemiológico como dispersor biológico o H.I. de nematodos de interés médico y veterinario. Por otro lado, las helmintiosis forman parte de las enfermedades tropicales desatendidas (Neglected tropical diseases-NTDs) y su casuística también se ven afectadas por el incremento en los indicadores bioclimáticos. Se han realizado estudios donde se comprueba la capacidad del CGA como portador y dispersor importante de protozoos, 19 �geohelmintos y bacterias de interés sanitario (médico y veterinario) (A. Morocoima, et al., 2014). Según Matinella et al., (2009): Lissachatina fulica ha sido mencionado como transportador mecánico de diferentes estados de dispersión de helmintos de importancia sanitaria como Schistosoma mansoni, Trichuris spp., Strongyloids spp., e Hymenolepis spp., las cuales se encuentran en heces y secreciones mucosas del hospedero definitivo”. Por lo tanto, la presencia de éste molusco en un área determinada puede ser utilizada como indicadora de riesgo de importancia sanitaria. Por otra parte (Valente et al., 2017) expresa que […] La presencia del caracol africano gigante A. fúlica en Puerto Iguazú se considera alarmante, no sólo por su efecto negativo en poblaciones de moluscos nativos, sino también, por su papel como huésped intermedio de parásitos de Importancia médica y veterinaria. Este estudio constituye el primer registro de un nematodo Metastrongyloidea en A. fúlica en Argentina y también destaca la susceptibilidad de este molusco como intermedio anfitrión de otros helmintos de importancia para la salud. Con respecto a la salud Animal, Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) y Aelurostrongylus abstrusus (Railliet, 1898), son de importancia veterinaria, Angiostrongylus vasorum, produce infestación a nivel de la arteria pulmonar y el ventrículo derecho de los cánidos salvajes y domésticos. (Franco-Acuña et al., 2009; Maldonado Jr. et al., 2010). El Aelurostrongylus abstrusus causa la aelurostrongilosis’, también conocida como estrongiloidosis felina, con sintomatología variada como: Tos, estornudos, sibilancias, disnea, secreción ocular-nasal y pérdida de peso progresiva. Los gusanos adultos viven en los bronquiolos y conductos alveolares produciendo pulmonía granulomatosa subclínica en gatos (Headley, 2005), dependiendo de la carga parasitaria, edad y sistema inmune del animal. Aelurostrongylus abstrusus tiene una amplia distribución geográfica. (Bjork et al., 2000; Traversa et al., 2008; Barutzki & Schaper, 2013). 20 �En Argentina, se han reportado adultos de esta especie en gatos domésticos en Buenos Aires, Corrientes y Santa Fe (Idiart et al., 1986; Schiaffi et al., 1995). Varios gasterópodos han sido reportados como hospedadores intermediarios de A. abstrusus: Subulina sp; Arion sp; Cernuella virgata; Achatina fúlica; Helix aspersa y Rumina decollata (Hobmaier y Hobmaier, 1935; Thiengo et al., 2008; Ohlweiler et al., 2010; Di Cesare et al., 2013; Cardillo et al., 2014). L. fulica también fue reportada cómo hospedador intermediario de nematodos del género Strongyluris (Heterakidae) (Franco-Acuña et al.,2009), los cuales no tienen impacto sobre la salud humana y son parásitos principalmente de reptiles como ser: Strongyluris oscari Travassos y Tropidurus spinulosus en el noreste de Argentina. (Sutton et. al. 1998). 2. JUSTIFICACIÓN _______________________________________________________________ 2.1. Implicancias del Caracol Gigante Africano A nivel mundial las implicancias sobre la salud humana, animal, ambiental y la economía de las poblaciones afectadas por esta plaga invasora, estimularon la instalación de acciones de control en los países que exhiben esta problemática. En Argentina al día de hoy, por su rápida dispersión y riesgos que implica, se lo mantiene en la agenda de los Sistemas Sanitarios y ambientales como un problema que demanda vigilancia y control. En ese sentido y por lo reflejado en encuestas realizadas, aún se requiere de esfuerzos conjuntos entre organismos nacionales, provinciales y municipales para su mayor conocimiento, vigilancia y control, como también, en la difusión y concientización de la problemática. En este sentido se hace necesario aumentar el conocimiento científico sobre la biología de esta especie invasora y desarrollar estrategias de 21 �acción que lleguen a la comunidad y su conjunto, que permitan realizar las medidas preventivas para alcanzar de manera eficaz la protección de la salud en toda la población. 2.2. Planteamiento del problema En la Argentina, el caracol gigante africano fue detectado oficialmente en junio de 2010 en la provincia de Misiones (Gutiérrez Gregoric et al., 2011) y posteriormente en la ciudad de Corriente (Gutiérrez Gregoric et al., 2011). En abril de 2019, fue detectado en un barrio de la localidad de Wanda, Misiones (50 Km al sur de Puerto Iguazú) y en el mes de mayo del mismo año, en la Localidad de Eldorado (51 Km al sur de Wanda), por el SENASA – DNPV y Centro Regional NEA. La expansión del CGA actualmente en la ciudad de Puerto Iguazú se encuentra prácticamente en toda la localidad, afectando diferente puntos geográficos como ser: Ribera del Paraná y zonas del puerto, villa nueva, Santa Rosa, villa alta, villa 14, barrio las orquídeas, barrio alto de Iguazú, entre otros. A diferencia de Corrientes capital, en la cual el foco de infestación continúa acotado a una zona reducida, motivo por el cual, en éstos lugares se tienen que redoblar esfuerzos para su control y erradicación, como también, en la difusión y concientización de la problemática. 2.3. Preguntas de investigación ¿Cuál es el estado actual de dispersión del CGA? ¿Puede actuar el CGA como amplificador y hospedador intermediario de parásitos?, ¿Las muestras de materia fecal y moco de CGA, presentan protozoos y helmintos de importancia sanitaria? ¿La población de la Provincia de Misiones conoce los riesgos del CGA? ¿Puede diferenciarlo de un caracol nativo? 22 �3. OBJETIVOS ______________________________________________________________ Con el fin de conocer y contribuir al estado actual del caracol gigante africano, Lissachatina fúlica, en el transcurso de la presente tesis se plantearon los siguientes objetivos generales y específicos. 3.1. Objetivo general Evaluar la epidemiologia actual del caracol gigante africano y sus implicancias en la salud pública y ambiental de la provincia de Misiones, Argentina. 3.2. Objetivos específicos 1. Realizar un relevamiento de situación del caracol gigante africano en la provincia de Misiones, Argentina. 2. Colectar y realizar la identificación morfológica de tallas de las conchillas de caracoles gigantes africanos de Puerto Iguazú, Misiones, Argentina. 3. Buscar e identificar la presencia de parásitos de interés sanitario en secreciones y material de desecho de caracoles gigantes africanos. 4. Evaluar el grado de conocimiento y riesgos potenciales de la población de Misiones respecto al caracol Gigante Africano. 3.3 Alcance En la localidad de Puerto Iguazú, provincia de Misiones, Argentina el objetivo fue analizar morfológicamente y parasitológicamente los Caracoles Gigantes Africanos en el período de Diciembre 2018/Diciembre2019. Realizando además en el año 2019, una encuesta Epidemiológica en un total de once localidades de la provincia de Misiones. 23 �3.4. Hipótesis La presente tesis por optar por un diseño descriptivo- exploratorio carece de hipótesis inicial. No obstante al tener una connotación pronostica se plantea las siguientes hipótesis predictivas: 1). Con el conocimiento documentado, de que poblaciones humanas y animales de Misiones presentan parásitos zoonóticos de importancia sanitaria y por los hábitos de alimentación del Caracol Gigante Africano, nos planteamos si en Puerto Iguazú el respectivo molusco, Lissachatina Fulica, podría actuar como transportador mecánico de especies parasitas (con énfasis en helmintos) de interés sanitario. 2). El grado de conocimiento de la población inciden en la dispersión. 4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA Valente (2017) en su Tesis Doctoral, evaluó la distribución, dispersión y parasitofauna del CGA, Lissachatina fulica en la ciudad de Puerto Iguazú, Misiones, y de las babosas nativas Phyllocaulis variegatus y Latipes erinaceus (Veronicellidae), con el fin de determinar su rol en la transmisión de helmintos parásitos, con especial énfasis en los nematodes Metastrongylidae. Realizando el muestreo principalmente en el área urbana durante los años 2013 – 2015. Concluyendo que la distribución espacial de L. fúlica en la ciudad de Puerto Iguazú, desde su introducción (2010) hasta la culminación de su estudio se incrementó, encontrándose durante este estudio nuevas áreas de focos, distantes 3 km del área foco inicial. Atribuyendo la dispersión entre otras causas a la influencia antrópica. Por análisis de mapas predictivos de distribución de nicho ecológico, Valente (2017) predice que L. fúlica en el 2050 se localizará por debajo de la línea del Ecuador, dispersándose a nuevas áreas que en la actualidad no poseen las características ambientales para su desarrollo. En relación a los parásitos, hallaron tres especies de helmintos parásitos en los hospedadores 24 �analizados: Brachylaima sp. (Digenea: Brachylaimidae), Strongyluris sp. (Nematoda: Heterakidae) y Aleurostrongylus abstrusus (Nematoda: Angiostrongylidae). En este trabajo, Valente sugiere que se continúe con el monitoreo del CGA y su parasitofauna, teniendo en cuenta la cercanía a zonas fronterizas con registros de Angiostrongyliasis. En otros trabajos desprendidos de su Tesis Doctoral, Valente y col., (2016, 2017) manifiestan que el tamaño de la concha se correlaciona con la prevalencia parasitaria, la intensidad media y abundancia media, indicando la existencia de una infestación constante en lugar de una accidental. Por otro lado, la ausencia de infección en el tamaño de concha más pequeño sugiere un umbral de tamaño a ser infectado. Todos los caracoles infectados pertenecían a la ciudad de Puerto Iguazú. Teniendo en cuenta las características morfológicas de las larvas encontradas en los citados estudios, Valente y col., concluyen que teniendo en cuenta que existen registros de CGA infectados por nematodos de importancia médica y veterinaria como Angiostrongylus y Aelurostrongylus en algunos Estados brasileños cercanos a Puerto Iguazú, enfatizan nuevamente en la necesidad de vigilancia epidemiológica de los caracoles gigantes africanos. En otra publicación Valente y col., (2018) integran y muestran la distribución actual de las especies de Angiostrongylus spp. En las Américas versus informes de enfermedades”. En el mismo concluyen que en Argentina, A. costaricensis se registró solo en una especie de roedor (A. montensis) en la provincia de Misiones, mientras que se notificó un caso humano único de enfermedad en la provincia de Tucumán (Demo & Pessat, 1986). Las características de los ambientes y las condiciones climáticas de ambos sitios geográficos son muy diferentes y la distancia cronológica entre estos informes es de 30 años. Este tiempo excede los períodos observados en el resto de los registros de esta especie (0-24 años). La falta de informes sobre anfitriones accidentales y definitivos en Argentina es paradójica, especialmente considerando que no hay datos precisos sobre la procedencia del paciente en el único caso humano registrado. Sin embargo, varios casos humanos registrados en Brasil desde 1990 se encuentran a 500 km de la provincia de Misiones. Por lo tanto, el 25 �riesgo potencial aumenta teniendo en cuenta que los límites entre las poblaciones de humanos y animales salvajes en el bosque atlántico se están volviendo cada vez más difusos. En el Estado de Nigeria, Igbinosa, (2016) en su trabajo “Parasites of edible land snails in Edo State, Nigeria”, encontraron larvas en el CGA de Angiostrongylus cantonesis, Fasciola gigantica y Schistosoma mansoni. Concluyendo que los caracoles terrestres son fuentes de proteínas para el hombre y son anfitriones de varios parásitos. El consumo de caracoles podría ser una ruta a la infección humana particularmente cuando se come crudo o poco cocido. En Venezuela, Libora y col., (2010) informaron que el CGA tiene la capacidad de albergar al parasito trematode S. mansoni que causa la esquistosomiasis intestinal en el hombre. Ovidio y col., (2019) en un estudio realizado en el Sur de Italia evalúa la ocurrencia de nematodos en los CGA mantenidos como mascotas. Evaluando muestras fecales y moco de los moluscos encontraron presencia de nematodos Rabditis sp. Los Rhabditidae incluyen nematodos saprófitos de vida libre, que se encuentran ampliamente en el suelo y los desechos orgánicos donde se alimentan principalmente de bacterias. Muchas especies de caracoles pueden servir como hospedadores definitivos. Sin embargo, varias especies de Rhabditis y Rhabditella se han asociado con vertebrados, incluidos los humanos. Aunque su presencia puede ser el resultado de la contaminación ambiental, estos nematodos pueden causar enfermedades en muchos animales y humanos. Rhabditis elongata, Rh.Hominis y Rh. Usuii, se han aislado larvas de heces humanas, orina y torundas vaginales. Estos autores concluyen, que todos los CGA pueden presentan huevos, larvas y nematodos rabdítidos adultos en las heces y, por lo tanto, pueden representar una fuente de infección para otras mascotas y humanos. En Brasil, Silva y col., (2019) en un estudio realizado en el Estado de Aracaju, Sergipe para verificar la ocurrencia del CGA y los riesgos potenciales asociados con su 26 �presencia. Concluyeron que el CGA era más representativo en áreas urbanas, especialmente en lotes baldíos con presencia de basura y materiales en descomposición. En los moluscos examinados se encontraron nematodos género Rhabditis, pero no se encontraron parásitos del género Angiostrongylus. Identificaron una relación significativa entre la humedad – frecuencia y la positividad de los nematodos y una correlación entre factores climáticos y la frecuencia de CGA. También observaron que cuanto más grande es el molusco, mayores son las posibilidades de infección por nematodos. Penagos – Tabares y col. (2019), en su trabajo “Angiostrongylus vasorum y Aelurostrongylus abstrusus: Parásitos desatendidos y subestimados en América del Sur”. Concluye que: teniendo en cuenta la amplia distribución de angiostrongilosis canina y aelurostrongilosis felina en América del Sur, es de gran interés que los médicos de práctica de pequeños animales y de vida silvestre consideren estas infecciones y las especies menos comunes como C. vulpis, T. brevior, T. subrenatus, A. chabaudi, A. felineus y O. rostratus; como diagnóstico diferencial en el caso de trastornos cardiopulmonares. En este mismo estudio Penagos – Tabares y col., refieren que los estudios filogenéticos también están pendientes para evaluar si A. vasorum de América del Sur en realidad representa un genotipo o especie distinto. Se requieren encuestas epidemiológicas en cánidos y felinos domésticos y salvajes, así como en hospedadores paraténicos e intermedios con una caracterización molecular precisa. Además, el impacto de los factores climáticos (por ejemplo, altitud, temperatura, precipitación anual, humedad relativa y región biogeográfica) en las interacciones huésped-parásito y parásito-huésped intermedio y la propagación de estos parásitos a regiones no endémicas son temas relevantes a considerar en futuras investigaciones en una de las regiones con mayor biodiversidad del planeta. 27 �5. MARCO METODOLÓGICO La investigación contó con la autorización por parte del SENASA, Regional CORMIS, Argentina. 5.1 Área de estudio 5.1.1. Características de la Provincia de Misiones La Provincia de Misiones con una superficie de 29.801 kilómetros cuadrados se localiza en el sector sudoccidental de la Gran Cuenca Sedimentaria del Paraná, ubicada entre los paralelos 25º 28´ y 28º 10´de Latitud Sur y los meridianos 53º 38´y 56º 03´de Longitud Oeste en la Región Nordeste de la República Argentina. El perímetro misionero, de 1.200 Km de longitud, ofrece 1.080 Km como fronteras internacionales: unos 330 km sobre el Río Paraná con Paraguay y unos 750 Km sobre los ríos Uruguay, Pepirí Guazú, San Antonio e Iguazú con Brasil. Una pequeña porción de 110 km de su territorio al sur es limítrofe con la Provincia de Corrientes (Instituto Geográfico Militar). Se encuentra organizada políticamente en 17 departamentos, divididos en 75 municipios. 28 �Figura 3: División política. Provincia de Misiones, Argentina (Fuente: Margalot J. A. Geografía de Misiones. 6 ed. Buenos Aires, 1994.) Ambiente, regiones naturales Desde el punto de vista fitogeográfico, Misiones se ubica en el Dominio Amazónico. Se caracteriza por un clima subtropical húmedo, con suelos lateriticos, con alto contenido de óxido de hierro y aluminio, materia orgánica y bajo tenor de sales solubles expresado en cloruros y sulfatos y reacción ácida. El total de lluvias anuales varía de 1000 a 2200 mm por año, y la temperatura media anual es de 16 – 20° C. El 35% de su territorio está ocupado por Selva Misionera o Selva Paranaense que cubre en la actualidad la zona central y norte de la provincia de Misiones, esta área posee una oferta de ecosistemas sumamente variada (Ministerio del Interior, 2010). La mayor parte de esta selva remanente yace dentro de lo que se denomina Corredor Verde, un área de conservación y uso sustentable de más de 1.100.000 hectáreas, creada mediante una ley provincial 3631 (García Fernández, 2002; Cinto & Bertolini, 2003) para evitar la fragmentación de la selva. La Provincia cuenta con 84 áreas protegidas, de las cuales 23 corresponden a la Selva misionera. 29 �Las áreas seleccionadas para el presente estudio corresponden: a la ciudad de Puerto Iguazú (25º36’S,54º35’O) para la etapa 1º del estudio. La misma se encuentra ubicada en la provincia de Misiones (Argentina) ocupando el punto extremo al noroeste de la Provincia en el cruce de fronteras con Paraguay y Brasil. Se halla rodeada por dos grandes ríos, el Paraná al oeste y el Iguazú al norte (Figura 4). Para la etapa 2º se seleccionaron ubicadas de Norte a Sur de la provincia. Figura 4: Imagen satelital de la ciudad de Puerto Iguazú, Misiones, 5.2. Universo Argentina El universo del presente estudio los constituyen los CGA obtenidos de la ciudad de Puerto Iguazú y la población humana de diferentes departamentos de la provincia de Misiones, como también el ambiente. 5.3. Diseño metodológico del estudio El diseño metodológico seguido fue de tipo exploratorio-descriptivo- observacional. 30 �5.4. Diseño muestral El diseño se basó principalmente en un diseño de campo de corte transversal con enfoque cualitativo – cuantitativo y una estrategia de muestreo intencional y de conveniencia. 5.5 Período de estudio El período bajo estudio fue entre diciembre 2018 a diciembre de 2019. 5.6 Criterios de inclusión / Criterios de exclusión Criterios de inclusión: - Se incluyeron para el muestreo moluscos que pertenecieran a la especie Lissachatina Fulica y sus materias fecales de la localidad de Puerto Iguazú. - Se incluyeron para las encuestas epidemiológicas: Localidades fronterizas de la provincia de Misiones. Criterio de exclusión: - Se excluyeron especies de moluscos nativos y sus excreciones. - Se excluyeron localidades sin pasos fronterizos con la República del Paraguay o con la República Federativa del Brasil. 5.7. Recopilación y análisis de la información Para la recopilación y análisis de información primaria, se realizaron colectas de moluscos, encuestas entrevistas y observaciones en terreno para relevar información sobre el CGA. Se realizó una búsqueda sistemática de literatura publicada sobre estudios de L. fulica en el mundo y a nivel regional y provincial: Biblioteca Virtual de Salud (BVS), 31 �Scientific Electronic Library Online (SCieLO), Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal (REDALyC) y Google Académico. Con el fin de complementar la identificación de los factores que influyen o podrían influir en la aparición o persistencia del CGA en Misiones se recolectaron los siguientes datos secundarios con sus respectivos indicadores: - Demográficos: Se obtuvieron por consulta de los datos de los Censos de Población y Viviendas. Al momento de redactar este manuscrito se actualizó con el último censo 2010. - Geográficos: Se recolectaron aquellos correspondientes a hidrografía, regionalización y topografía. Se utilizó información disponible en Bibliotecas regionales e Institutos Geográficos. - Edafológicos: Se estudió la cartografía y la composición de suelos a través de búsquedas en Bibliotecas de las Secretarías de Minería. - Agropecuarios: Se recurrió al Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) y al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). - Ambientales y Ecológicos: características del lugar, temperatura, clima, humedad relativa, ecosistema de la Provincia de Misiones. 5.7.1. TRABAJO DE CAMPO Las colectas de moluscos en la ciudad de Puerto Iguazú así como, las encuestas y observaciones, fueron realizadas en su totalidad por el investigador y personal de SENASA. 5.7.1.1. Recolección de moluscos. La colecta de caracoles bajo estudio, se llevó a cabo por el método de captura por remoción (Valente 2017) mediante colecta manual, ayudados por elementos de jardinería tales como rastrillos y palas. 32 �El cronograma de colectas del CGA, se estableció por criterios locales, climáticos y por accesibilidad geográfica. Los muestreos se realizaron durante los meses de enero a abril del año en estudio. Tanto la colecta, traslado y procesamiento de los mismos se realizaron bajo Normas de Bioseguridad establecidas por organismos competentes. Los ejemplares colectados de diferentes espacios que correspondieron a viviendas, suelo, paredes, vegetación, arbustos, hojarasca, rocas y troncos caídos fueron colocados en recipientes de plástico secos con tapa perforadas al cual se le agrego papel higiénico húmedo induciéndolos a entrar en un estado de estivación. Cada recipiente fue debidamente codificado según lugar de recolección y trasladados por personal de SENASA al laboratorio de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNNE, Corrientes y la Facultad de Veterinaria de la Universidad del Salvador, Sede Gobernador Virasoro, Corrientes para ser procesados. Se colectaron un total de 201 ejemplares de moluscos. Figura 5: Colecta de moluscos en la Ciudad de Puerto Iguazú, Misiones, Argentina. 33 �5.7.1.2. Encuestas a la población. Para tener una aproximación del grado de conocimiento del CGA en la provincia, se trabajó con fuentes primarias de información (encuestas de tipo epidemiológicas) dirigidas a la población de 11 (once) localidades de la provincia de Misiones, entre los meses de Mayo y septiembre de 2019. El diseño del cuestionario estuvo constituido por 12 preguntas de tipo dicotómicas y de respuestas múltiples (Ver ANEXO V). En la Figura 5, se muestra el mapa de Misiones indicando las zonas evaluadas con y sin declaración Oficial de presencia de CGA. Se incluyeron además entrevistas verbales con apoyo de documentación fotográfica y muestras de especímenes que permitieron reconocer la presencia del CGA por parte de la población. Total de encuestas realizadas: 92 (noventa y dos) encuestas. A todos los encuestados se les entregaron folleto informativo. (Guía de reconocimiento en campo) sobre el CGA, cómo reconocerlos, diferencias con caracoles nativos y recomendaciones por parte del SENASA (Ver ANEXO VI a y b), a fin de sensibilizar y contribuir a la prevención del mismo. 34 �Figura 6: Mapa de la Provincia de Misiones indicando zonas evaluadas por encuestas epidemiológicas. 5.7.2. TRABAJO DE LABORATORIO 5.7.2.1. Estudios macroscópicos - morfológicos de los moluscos En el laboratorio los caracoles colectados fueron sometidos a la técnica de preservación, relajamiento y muerte con cristales de mentol, en el cual permanecieron entre 12 a 15 hs. Una vez transcurrido ese tiempo, se cambió el agua por formol al 10% para su fijación y ser posteriormente examinados, medidos y agrupados según se muestra a continuación: 35 �A. Agrupamiento por género y especie B. Clasificación en Clase según categoría de tamaños: Clase I: individuos recién eclosionados (hasta 10 mm) Clase II: juveniles (10 a 40mm) Clase III: adultos jóvenes (40 a 70 mm) Clase IV: adultos (> 70 mm) Figura 7: Identificación morfológica de los moluscos, estableciendo largo, ancho y alto. 5.7.2.2. Estudios parasitológicos Para la búsqueda de parásitos en: - Materia Fecal: Primeramente se realizó el procesamiento por pool de muestras, por cada grupo conformado. Se realizó la observación de parásitos en la materia fecal siguiendo el esquema propuesto: a). Observación Macroscópica: directa ayudados con una lupa, con el objeto de observar parásitos adultos. b). Observación Microscópica: previo procesamiento con técnicas ya descriptas, para Nematodos, protozoarios y cestodes de la flia. Anoplocephalidae, mediante flotación, (método de Willis y Sheather) y sedimentación (método de Teleman). 36 �- Baba: Se realizaron estudios en fresco entre porta y cubre objetos y además se concentraron las muestras mediante centrifugación y realizando el examen directo del sedimento según técnicas descriptas por otros autores. Durante el manejo de ambas muestras, en toda instancia se respetaron las normas de bioseguridad. Las observaciones se realizaron haciendo uso de dos microscopios con biocular micrométrico (Olimpus®, modelo CHS y Carl Zeiss). Para la identificación taxonómica de géneros y/o especies (protozoos y helmintos) se usaron criterios morfológicos (forma, cubierta, color, contenido) y métricos (longitud y diámetro) descriptos previamente (Acha et al 1986; Soulsby E., 1987; Bowman et al 2004; Manuales del Dto Parasitologia Malbran). Los resultados de las lecturas microscópicas fueron registrados en un formulario al final del cuestionario que contemplaba el código de cada colecta de moluscos. Finalizado el trabajo, todos los ejemplares fueron eliminados siguiendo las recomendaciones establecidas por el SENASA, que consiste en colocar los caracoles durante un tiempo mínimo de 4 horas en un recipiente con 3lts. de agua y 1kg de sal común. Al finalizar, fueron enterrados con cal a una profundidad mínima de 50 cm. 5.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos fueron cargados y procesados en los programas Microsoft Excel 2007, Acess 2007. Se utilizó la prueba estadística chi cuadrado y comparación de proporciones, trabajando con un nivel de confianza del 95% y una precisión del 5 %, utilizándose para su procesamiento el programa estadístico InfoStat® para la correlación de las variables y gráficos. 37 �6. RESULTADOS 6.1. ESTUDIO DE SITUACIÓN. PROVINCIA DE MISIONES. Los datos presentados a continuación, son conducentes para un análisis conjunto de información y el conocimiento respecto al CGA en la provincia de Misiones. Indicadores demográficos, gasto público, de recursos: su impacto. Demográficos Según los datos del censo de 2010 la provincia tiene 1.101.593 habitantes y una densidad poblacional de 37,0 hab/km2. Esto representa al 2,7% de la población nacional, y convierte a Misiones en la novena provincia más poblada, por delante de Chaco y por detrás de Salta. En referencia a la población por sexo, los varones representan 547.335 en la totalidad del mapa provincial (49.9%), mientras que las mujeres alcanzan el número de 554.158 personas (50.3%). Respecto al censo anterior, de 2001, la población creció un 14,1 %. Por otra parte, en el censo de 2010 el crecimiento demográfico sigue aglutinado en el sector urbano con una población de 812.554 habitantes, respecto a la población rural con 288.939 habitantes, representando el 26.2 % de la población. Del total de los pobladores rurales, el 81,2 % vive en zonas consideradas "dispersas" (parajes y picadas). Por otra parte, 33 son las jurisdicciones municipales de la provincia que cuentan con una población totalmente rural. Población de pueblos originarios: El porcentaje de la población que se autoreconoce como indígena o con algún antepasado perteneciente a algún pueblo originario (Mbya Guarani) es del 1,1 % (13.006 38 �personas). Un 49.97 % del total, viven en zonas rurales (Corredor verde Ecológico 23 %, predios privados 19 % y reservas ecológicas 4 %). Dentro de las estadísticas vitales de la población Mbya Guaraní, para el año 2010 se observó una tasa de natalidad por 1000 habitantes de 23,1 %; registro inferior al año 2004 (26,1 %). Población extranjera residente en Misiones Se estimó según Censo 2010, un total de 44.012 extranjeros residentes en la provincia: 20.870 varones y 23.142 mujeres. Los inmigrantes que más suman en las estadísticas son los oriundos de países limítrofes (40.660 personas): paraguayos, con 26.799 habitantes; brasileros, 13.000 personas. Los europeos, 2.063, en su mayoría españoles y alemanes. Por su parte, la comunidad asiática en Misiones alcanzó la cifra de 492 residentes; africanos 16 personas y los oriundos de Oceanía, 85. Viviendas y hogares El total de viviendas a nivel provincial es de 330.631, en tanto que el total de hogares es de 302.953. Del total de viviendas, 290.263 están habitadas, 39.786 se encuentran deshabitadas y las 582 restantes pertenecen a la categoría de viviendas colectivas. Del total de hogares en la provincia, 217.858 (71.9%) cuentan con provisión de agua mediante el suministro de la red pública. Analfabetismo Se observó una disminución del analfabetismo, pasando del 6,2% en el 2001 al 4,1% en el 2010. A nivel país, el índice de personas que no saben leer ni escribir disminuyó considerablemente, pasando del 2,6% en 2001, al 1,9% en 2010. 39 �Gasto público por finalidad y función El principal componente del gasto público de la provincia es la categoría Servicios Sociales, que insume el 49,5% del total. Dentro de este grupo se destaca Educación y Cultura, que insume el 29,2% del gasto total de la provincia de Misiones. Vivienda y urbanismo agrupa a otro 9,4%, y Salud a un 7,8%. La categoría Servicios económicos representó un 23,6% del gasto, mientras que Administración Gubernamental implicó otro 19,5%. Los servicios de seguridad insumieron un 5,2% del gasto provincial, y los servicios de la Deuda otro 2,3%. Indicadores de recursos y utilización de servicio de salud La provincia cuenta con 617 establecimientos, de los cuales 372 pertenecen al sector público. Entre los mismos, encontramos Postas, Unidades, y Puestos Sanitarios, Consultorios periféricos, consultorios externos y Hospitales. Población canina Para un total de 1.097.829 habitantes, se estiman 548.914 perros a nivel provincial (Programa Provincial Control de Enfermedades Zoonóticas, Ministerio Salud Publica de Misiones, 2013), con una relación de 1 perro cada 2 habitantes (Relación Mundial: 1/3 habitantes). Explotaciones agropecuarias (EAP): Según el Censo Nacional Agropecuario, 2018, la provincia de Misiones cuenta con 22.169 EAP, presentando casi el doble de unidades productivas que Chaco y Corrientes, y tres veces más que Formosa. 40 �6.2. ANÁLISIS MORFOLÓGICO DE LOS MOLUSCOS De los 201 moluscos analizados se identificaron 199 moluscos del género y especie L. fulica (tabla 1) en la ciudad de Puerto Iguazú, Misiones. Teniendo en cuenta el tamaño de los moluscos del Grupo I, en la tabla 2 se presenta la clasificación por clase de L. fulica colectados. Observándose que el mayor número presentan las formas juveniles (Clase II) con un rango de 10 a 40 mm, seguidas por formas juveniles (Clase III). Tabla 1. Identificación por grupo según género y especie de molusco evaluado. Pto. Iguazú, Misiones, Argentina. Género y especie de molusco Lissachatina fulica Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 199 Helix aspera 1 Bulimus spp. 1 Tabla 2. Clasificación por Clase según categoría de tamaños de moluscos del Grupo 1 evaluados. Puerto Iguazú, Misiones, Argentina. Clase I Grupo 1 6 Clase II 149 Clase III 35 Clase IV 9 6.3. ESTUDIOS PARASITOLÓGICOS Del análisis parasitológico efectuado a los pooles de materia fecal de L. fulica, se encontraron taxones parasitarios correspondientes a géneros del Phylum Nemata y del Phylum Protozoa (Figura 8). 41 �Entre la clase Secernentea predominaron larvas del orden Strongylida y larvas de vida libre sin especificar, como también se observaron huevos de nematodes del genero Ancylostoma spp. (60 µm x 40 µm). Los protozoos observados correspondieron a quistes de Ameba spp.; Giardia spp. y de la Clase Aplicomplexa a ooquistes de Cystoisospora spp. Por su parte en el análisis de baba de 9 ejemplares adultos de L. fulicas se encontraron taxones parasitarios de la Clase Nematoda Orden Strongylida: larvas de nematodes sin especificar (4/9) y del Orden Ascaridea Familia Toxocaridae: huevos de ascarideos (1/9) compatibles con el genero Toxocara spp. La relación entre zonas de muestreo y taxones parasitarios, no presentaron diferencias significativas (p>0,05). En 4 de 9 muestras de baba se observaron cristales de oxalato de calcio. Figura 8. Taxones parasitarios encontrados en Materia fecal y baba de CGA. Parte superior: larvas de Strongylida y de vida libre. Parte inferior: huevos de Ancylostoma spp, quiste de Giardia spp, oquiste de coccideo. 42 �6.4. EVALUACIONES CUALITATIVAS. Conocimiento del Caracol Gigante Africano (L. fulica) por parte de la población de Misiones. En la tabla 3 se muestra la distribución por localidades de las 92 personas encuestadas y el grado de conocimiento acerca del CGA. Observándose un 67.4 % de desconocimiento sobre la problemática (Gráfico 1). El promedio de edad de los encuestados fue de 43 años (86 – 21). Tabla 3. Conocimiento del Caracol Gigante Africano por parte de la población. Provincia de Misiones, Argentina. N° Escucharon Localidades Lo vieron Encuestados hablar 9 4 0 Corpus Montecarlo 12 0 0 Eldorado 10 2 1 Wanda 9 5 2 Pto. Iguazú 10 6 9 Andresito 5 3 0 San Antonio 8 1 1 B. de Iigoyen 9 5 3 El Soberbio 5 2 0 Alba Posse 10 2 0 San Javier 5 0 0 TOTAL 92 30 16 43 �Escuchó hablar del caracol? 0,7 0,7 0,6 0,6 0,5 0,5 0,4 0,4 0,3 0,3 Sí escuchó No escuchó Gráfico n° 1. Porcentajes de la población encuestada que escucharon o no escucharon hablar sobre el Caracol Gigante Africano. Respecto a la variable haber visto el CGA, solo un 17.4% de estos lo vieron en sus viviendas, patios, paredes, huertas o en las proximidades de las mismas (Gráfico nº 2), ocurriendo un 31.2% de estas observaciones en épocas de verano, un 18.7% en primavera y un 12.5% finales de verano e inicio de otoño. Por otra parte, de las personas que vieron el CGA en sus huertas 2 refirieron haberlos visto alimentándose de verduras de hojas. De esta variable un 0.03 % de los encuestados no respondieron a la pregunta. La correlación entre las personas que escucharon y los que vieron al caracol, fue estadísticamente significativa (p<0,0001). Por otra parte, con una alta significancia estadística (p<0,0002) se correlacionaron negativamente los datos entre los que escucharon y los que no vieron al caracol. 44 �Vió los caracoles? 0,8 0,8 0,7 0,6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,3 0,2 0,1 Sí lo vió No lo vió Gráfico 2. Porcentajes de la población encuestada que vio al Caracol Gigante Africano. De las encuestas realizadas, también se desprende que el 61.9% de los encuestados presentan menores de 15 años en sus familias, con un promedio de 2 hijos por matrimonio, de los cuales el 45% andan descalzos en sus domicilios. En relación a la tenencia de mascotas, un 59.7% presenta mascotas en sus domicilios, perros (57.6%) y gatos (18.4%), con un promedio de 2 perros y 4 gatos por familia. Por otra parte, se resalta que un 18,4%, refirió ver ratas en su domicilio o peri domicilio. En cuanto al modo de eliminar al CGA de sus viviendas, solo un 4.34% (4/92) refirieron eliminarlos con sal o sal y fuego. 45 �7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES El CGA, es una de las especies invasoras más agresivas para la agricultura y la diversidad biológica a escala mundial. En Salud Publica, es catalogado de interés por actuar como vector y dispersor de diferentes especies de microorganismos entre ellos parásitos zoonóticos, de alta implicancia para la salud humana y animal. En la ciudad de Puerto Iguazú, entre otras localidades de la provincia de Misiones y de regiones vecinas, el panorama del CGA presenta una alta probabilidad de acrecentarse debido a su alta tasa de dispersión asociado a variables antrópicas. Algunas de las causas atribuibles por la cual se produjeron nuevos y múltiples focos en diferentes zonas de Puerto Iguazú, pueden estar relacionadas con los movimientos de suelo. Por el traslado de tierra para cubrir calles empedradas de distintos barrios, como también, se puede explicar la aparición del molusco en barrios aledaños al basural del municipio, ya que la gente al juntar a los CGA los desecha a la basura sin su correcta eliminación previa (por ej. por deshidratación con sal). En concordancia con Valente (2017), en el presente estudio se encontraron nuevas áreas de focos, distantes a 52 km de la localidad registrada inicialmente en 2010. Al igual que otros autores, se constató que sitios baldíos y basurales de zonas urbanas y periurbanas, son los lugares de mayor presencia de moluscos por metro cuadrado (Silva y col., 2019). Respecto a la presencia de parásitos en el CGA, en concordancia con los trabajos de (Valente et. al., 2016, 2017; Silva et. al., 2019), se observó que la carga parasitaria de los moluscos es directamente proporcional al tamaño, encontrándose en este estudio taxones parasitarios del orden Ascaridea y Strongylida, en los CGA en estado adulto joven y adulto. Aún, no habiéndose encontrado parásitos del género Angiostrongylus en estos especímenes, los CGA de mayor tamaño presentan un mayor riesgo epidemiológico al ser mayor su 46 �longevidad y oportunidad de contacto con ambientes contaminados con formas parasitarias eliminadas por heces de animales parasitados. Las variables climáticas son capaces de afectar prevalencias, intensidades y distribución geográfica, tanto directamente, influenciando sobre los estadios de vida libre, como indirectamente sobre los hospedadores/vectores (Mas-Coma et. al., 2009). Misiones, presenta todas las condiciones topográficas y climáticas para la persistencia de formas parasitarias y los hospederos o vectores adecuados para diseminarlas. En este trabajo queda demostrado que la baba de A. fulica utilizada para su locomoción y desplazamiento, también puede actuar por arrastre como dispersora de formas infectantes de parásitos zoonóticos, como ser huevos del genero Toxocara, hallados en el presente estudio y de importancia en la salud pública por el daño que ocasionan en el ser humano (Vizcaychipi et. al., 2006; 2014; 2016). Por otra parte, los hallazgos realizados por Igbinosa, (2016), en el Estado de Nigeria, África occidental y por Libora (2009) en Venezuela, demuestran la importancia de mantener una vigilancia epidemiológica constante respecto a los posibles cambios evolutivos entre parásitos y hospedadores, como por ejemplo: los trematodos de importancia sanitaria (médica y veterinaria) encontrados en los CGA. Los Trematodos Digénidos siguen un ciclo heteroxeno con un molusco como primer hospedador intermediario, comúnmente un gaterópodo terrestre o acuático. La Fasciola gigantica (parasito exótico) presente en Africa, Oriente Medio, Asia y Europa Oriental, comparte características biológicas idénticas con la Fasciola hepática, presente en nuestro país. Este último es causante de la distomatosis hepática, una zoonosis de importancia epidemiológica en la región Noreste de Argentina (Lobayan et. al., 2016). Por otra parte, el Schistosoma mansoni causante de la esquistosomiasis, enfermedad no reportada y en estado de vigilancia en la misma región, por presencia del vector gaterópodo. Si bien L. fúlica no es un molusco acuático o que comparte características biológicas con moluscos de los géneros Limnea spp o Biomphalaria spp, el 47 �sólo hecho de haber sido hallado trematodos en el CGA, amerita cautela y atención para futuras investigaciones. Otro trematodo exótico a nuestra región es el Dicrocelium, causante de la dicroceliosis, enfermedad de interés sanitario (médico y veterinario), más raro en humanos y con hospedadores intermediarios (moluscos), del género Helicella spp y Zebrina spp. Si bien son exóticos, comparten una característica con L. fúlica que es la coprofagia, necesaria para completar el ciclo biológico de la dicroceliosis, entre otras enfermedades parasitarias. Muchas de las enfermedades que hoy son endémicas, hasta hace poco eran exóticas. La posibilidad de que el CGA sea susceptible a estos trematodos, actuando como liberador de cercarias, sólo dependerá de su comportamiento evolutivo en el tiempo y del ciclo en constante dinamismo de las cadenas epidemiológicas y su relación huésped, agente y ambiente, resultando en constantes enfermedades emergentes y remergentes. En coincidencia con otros autores (Valente et. al., 2017,2018; Barratt & Ellis, 2019), se considera necesario continuar con el monitoreo y los estudios de parasitofauna en el CGA teniendo en cuenta factores epidemiológicos asociados, cercanía a zonas fronterizas con registros de Angiostrongyliasis entre otros parásitos zoonóticos de interés sanitario, así como también la presencia y valoración de la fauna animal representada principalmente por canidos, félidos y roedores. De las encuestas realizadas, se pudo constatar el escaso conocimiento de la población sobre el CGA, inclusive dentro de las áreas más afectadas. De la misma manera, se constató un insuficiente accionar por parte de las autoridades de los municipios en lo que respecta a educación sanitarias, prevención y control de la plaga; además se observó la necesidad de mayor coordinación conjunta y de accionar continuo entre los organismos municipales, provinciales y nacionales. 48 �8. COMENTARIO FINAL El desconocimiento tanto de las posibles implicancias sanitarias, ambientales o económicas de una plaga, como también, de los eslabones de la cadena epidemiológica, necesarias para el desenlace de una enfermedad, nos llevan a la imposibilidad de actuar en pos de la prevención, ya sea, del desarrollo de una enfermedad o para contrarrestar el avance del Caracol Gigante Africano y con mayor razón, si tiene como principal variable de expansión o saltos de dispersión a la actividad humana. De tal modo que resulta necesario afianzar en la educación y participación ciudadana como medidas preventivas para controlar esta especie invasora. Así mismo, se indican como medidas preventivas gubernamentales, el aprovechamiento de instrumentos legales existentes, y por sobre todo aprender a trabajar de forma integral y multisectorial entre todas las partes involucradas para su correcta vigilancia y control. 49 �9. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________________________ BIBLIOGRAFÍA CITADA -Albuquerque, F.S., Peso-Aguiar, M.C., Albuquerque, M.J.T, Gálvez, L. 2007. Do climate variables and human density affect Achatina fulica (Bowdich) (Gastropoda: Pulmonata) shell length, total weight and condition factor? Braz JBiol., 69: 879–885. -Alicata JE 1991. El descubrimiento de Angiostrongylus cantonensis como causa de meningitis eosinofílica humana. Parasitol Today 7 : 151-153. -Acha P. y Szyfres.2003. “Zoonosis y Enfermedades Transmisibles comunes al Hombre y a los Animales”. Vol. III - Publicación Científica y Técnica No. 580, p. 234 – 240. -Anderson R C. 2000. Nematode Parasites of Vertebrates. Their Development and Transmission2nd ed. CAB International (Eds). Wallingford, Oxon, U.K., p.650). -Barratt JLN, Ellis J. 2019. 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Title A name given to the resource Análisis parasitológico de importancia sanitaria en los caracoles gigantes africanos (Lissachatina fulica) en Misiones Creator An entity primarily responsible for making the resource Reinante, Emiliano Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2019 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Teibler, Pamela (Directora de Tesis); Alvarez, Darío y Vizcaychipi, Katherina A. (Co-Directores) Rights Information about rights held in and over the resource Trabajo presentado para obtención del titulo Magíster en investigación en Ciencias de la Salud otorgado por la Universidad Nacional del Nordeste Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Tesis Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0178 Abstract A summary of the resource. El presente trabajo realiza una evaluación de la situación epidemiológica y parasitaria del caracol L. fulica y sus implicancias en la salud pública de Misiones, Argentina, a fin de conocer y contribuir al estado actual de la citada especie. https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/39dd1833ac756eae39d3ff2b017fe40c.pdf 580cb04112f0314058bcc462b2431d2d PDF Text Text MANUAL DE PROCEDIMIENTO Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) Edición 2025 �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 6 Objetivos 6 Abreviaturas y definiciones 6 Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio 7 Principios de bioseguridad 7 Prácticas operativas seguras y hábitos personales 8 Limpieza y desinfección del laboratorio 10 Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) 10 Aseguramiento de la calidad en el laboratorio 10 Control de calidad de insumos 11 Equipos 13 Sobre la enfermedad 13 Descripción de la enfermedad 14 Infección por Brucella en ganado bovino 14 Infección por Brucella en ovejas y cabras 15 Infección por Brucella en cerdos 15 Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes 16 en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red 17 18 18 20 �Registro de entrada de muestras 20 Características y condiciones de las muestras 21 Condiciones de recepción de las muestras 21 Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las 21 muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) 22 23 para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo 23 Ejecución del ensayo de BPAT 23 Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala 24 Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de scree- 25 ning con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) 25 26 Desarrollo 26 Ejecución del ensayo 27 Incubación 28 Lectura e interpretación de resultados 28 Informes de resultados 30 Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME 31 Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos 31 Desarrollo 32 Toma de la muestra 33 Ejecución del ensayo 33 Lectura 33 Modificación de la prueba para tanques muy grandes 34 Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) 34 Etapas 35 Desarrollo 36 �ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos 38 38 41 contra brucella en suero Desarrollo 42 Ejecución del ensayo 42 Lectura e interpretación 43 Fijación de complemento 44 Desarrollo 44 Manejo y conservación de las muestras 45 Condiciones del ensayo 46 Ejecución 46 Lectura de resultados 48 Anexos 52 Bibliografía 68 �Introducción El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Estas técnicas son internacionalmente reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Objetivos • Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Redlab. • Proporcionar a la Redlab un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. • Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse cuando se desarrolle un procedimiento técnico. • Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Abreviaturas y definiciones • Ag: Antígeno • Biovariedad: bv • BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en placa • CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo • C’: Complemento de cobayo • DGLYCT: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico • DLA: Dirección de Laboratorio Animal • DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal • DT: Dilución de Trabajo • ELISA: Enzimoinmunoensayo • FCT: Fijación de Complemento Test • FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente • GR: Glóbulos Rojos • IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto • IgG: Inmunoglobulina G • IgM: Inmunoglobulina M • LPS: Lipopolisacárido • 2-ME: 2- Mercaptoethanol • M: Molar • mP: milipolarización MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 6 �• MRT (PAL): Prueba de anillo en leche • OMSA: Organización Mundial de Sanidad Animal • PAC: Poder anticomplementario • RBT: Rosa de Bengala Test • Renspa: Registro Nacional de Productores Agropecuarios • SAT: Seroaglutinación lenta en tubo • SB: Solución Buffer • Senasa: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria • SH: Sistema Hemolítico • UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro • UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro • UA: Unidad de Antígeno • UC: Unidad de Complemento • UH: Unidad de Hemolisina Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Se entiende por bioseguridad: La disciplina que trata el manejo seguro y la contención de microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos. La práctica del manejo seguro de microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación de los principios de contención y la evaluación de riesgos. Principios de bioseguridad El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos. Contención primaria: la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de Equipos de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de vacunas al personal cuando corresponda puede brindar un mayor nivel de protección del personal. Contención secundaria: la protección del medioambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas operativas. Por lo tanto, los elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Prácticas y técnicas de laboratorio: el elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 7 �estándares. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien informado acerca de las técnicas de laboratorio adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo. Cuando las prácticas de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento. El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del personal. Prácticas operativas seguras y hábitos personales • Limitar o restringir el acceso al laboratorio. • Diseñar el laboratorio para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos. • Seleccionar muebles de laboratorio con capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza. • Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos. • Adecuar la iluminación para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que pueda molestar la visión. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 8 �• Proveer mosquiteros para las ventanas del laboratorio que se abren hacia el exterior (en lo posible deberían ser fijas). • Usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas); además, usar calzado cerrado y cabello recogido. • Es obligatorio el uso de guantes cuando es probable que las manos entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados (puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes). Descartar los guantes cuando están contaminados y retirarlos cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar fuera del laboratorio. • No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo. • Utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial. • Lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I). • Almacenar los alimentos fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados con este único fin. • Está prohibido pipetear con la boca: utilizar dispositivos de pipeteo mecánicos. Aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes. • Llevar a cabo todos los procedimientos con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles. • Descontaminar las superficies de trabajo como mínimo una vez por día, luego de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable. • Descontaminar todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados antes de ser desechados mediante un método aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 9 �y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos. • El laboratorio debe tener las hojas de seguridad1 de cada sustancia química que utiliza en formato impreso y capacitar al personal sobre las mismas. Limpieza y desinfección del laboratorio Todo laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos para disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del lugar y volumen de trabajo. La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas, etc. Dentro de la limpieza se debe incluir el control de insectos y roedores. Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) El laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los residuos peligrosos ya que pueden causar daño, directa o indirectamente a seres vivos o contaminar el suelo, el agua, la atmósfera o el ambiente en general. Se consideran residuos patológicos/químicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a determinadas dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la salud, luego de estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía. Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en el lugar de generación de los mismos. Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: incineración, enterramiento por relleno de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a ese fin. Se ajustará a la normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio. Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (buenas prácticas de laboratorio), requisitos particulares del Senasa y la Norma ISO/IEC 17025 (última versión vigente) según la categoría del laboratorio. Es un documento que indica las particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado (en inglés, Material Safety Data Sheet o MSDS). El principal objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. Esta hoja o ficha contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales. 1 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 10 �Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados. Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser detectados para poder aplicar correcciones o acciones correctivas. Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos con la utilización diaria de sueros controles internos con títulos conocidos; mientras que el control externo –que se refiere al realizado por un laboratorio de referencia– se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad internos implementados. Respecto a la participación en ensayos interlaboratorios, los mismos deben ser provenientes de organismos reconocidos y programas de ensayos de aptitud. Se deben mantener documentados los resultados y, en caso de obtener resultados no satisfactorios, implementar las acciones correctivas pertinentes para su seguimiento y cierre. Del mismo modo podrán utilizarse otras herramientas a los fines de garantizar el desempeño adecuado y asegurar la calidad de los resultados de ensayo, como la confección de gráficos de control2. El control permanente de la calidad de los resultados junto con las buenas prácticas de laboratorio que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantiza el resultado confiable del diagnóstico. Control de calidad de insumos Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben ser establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo. La composición, el tipo de envase, la identificación y el lugar de almacenamiento deben ser los indicados en los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio. Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas. 2 Diagrama que sirve para examinar si un proceso se encuentra en una condición estable, o para asegurar que se mantenga en esa condición. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 11 �Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo deben utilizarse de acuerdo a las especificaciones del manual de procedimientos operativos correspondiente, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación. Los reactivos para el diagnóstico de brucelosis que se comercializan en la República Argentina, deben cumplir la normativa vigente del Senasa y aprobar el control de calidad de cada lote o serie indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de antígeno/kit que se utiliza con la fecha de uso. En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o pureza se encuentran establecidos sobre la base de diferentes normas o criterios, dependiendo de las instituciones u organismos internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran la American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes niveles de pureza del agua en función de los parámetros físico-químicos, tales como conductividad eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice. Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica. Especificaciones según ISO 3696 Parámetros Fisicoquímicos Grado 1 Grado 2 Grado 3 Conductividad eléctrica valor máximo a 25 ºC, µS/cm 0,1 1 5 Resistividad, MΩ 10 1 0,25 Absorbancia (UA a 254 nm) 0,001 0,01 -- Sílice Total valos máximo mg/l 0,01 0,02 1 pH -- -- 5,0 a 7,5 Clasificación de los tipos de agua según NC-ISO 3696: 2004 Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más exigentes, incluyendo la cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de una membrana con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice fundido). Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para análisis delicados, incluyendo la espectrometría de absorción atómica (EAA) y la determinación de componentes en cantidades mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u osmosis inversa seguida de destilación. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 12 �Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la preparación de soluciones de reactivos. Se puede preparar mediante una sola destilación, por desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo normal de análisis. Equipos El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el laboratorio. El equipamiento que afecte la calidad de los resultados de ensayo, debe mantenerse controlado, estipulando dentro de un programa los intervalos de control, calibración /verificación y mantenimiento de los mismos. Sobre la enfermedad3 Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones–humanas o animales– causadas por distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis) del manual de la OMSA. Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis) El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden Rhizobiales, en la clase alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la reaprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos relacionados con las seis especies de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las Fuente: Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad Animal -OMSA)- versión 2022. 3 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 13 �tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el reservorio natural de las mismas. Si bien solo se han descrito dos cepas de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado como nuevas especies de Brucella. Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción del microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo se encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos machos adultos pueden presentar orquitis/epididimitis y la brucelosis puede ser una causa de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por Brucella. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 14 �Infección por Brucella en ovejas y cabras La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causada principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva Zelanda. Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales de transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988). Infección por Brucella en cerdos La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B. suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis, pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis porcina puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de jabalíes. En general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la cópula también es frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días 50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infecMANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 15 �tados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones, cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6 meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al., 2012). La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en jabalíes parece ser alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares, sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres. Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos. Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis. Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano y el europeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el ganado bovino, ovino y caprino. La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje) se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos antropogénicos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 16 �Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son el hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por cohabitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y los caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microorganismos similares a B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado que son distintas de B. suis en función del perfil genético. Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos de tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor; a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden desarrollarse en casi cualquier lugar, a veces en el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos signos locales, como aborto, retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno, especialmente la médula ósea. Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Ciertas especies de Brucella, sobre todo B. melitensis, B. abortus, B. suis –y probablemente en menor medida B. canis– son fácilmente transmisibles al ser humano, en el que causan un proceso febril (fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones graves que afecten a los sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central. Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos constituye el principal riesgo para el MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 17 �público general en los lugares en los que la enfermedad es endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del riesgo biológico. Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS, 1953; OMS, 2004). Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos. Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos. Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se describen en este manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin embargo, los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico. Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FCT) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el ensayo de polarización fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 18 �En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado. Tabla 1 Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus, melitensis o suis (Manual OMSA, 2022). Propósito Método Demostrar ausencia de infección en la población Demostrar ausencia de infección en animales individualesa Contribuir a las políticas de erradicaciónb Confirmar casos clínicos sospechososc Determinar la prevalencia de la infección – vigilancia en el rebaño / manada Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones tras la vacunación - - Identificación del agente Métodos de tinción - Cultivo PCRd - - + +++ +/++ Detección de la respuesta inmune BBAT (RBT o BPAT) +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + +++ + +++ +++ + + + + ++ ++ ++ + +++ - +++ ++ +++ +++ ++ ++ + - Pruebas basadas en el NH y proteínas del citosole - - + ++ - - Prueba en leche de tanquef I- ELISA en leche o prueba de anillo en leche +++ - +++ + +++ - FPA CFT I-ELISA C-ELISA BST SAT Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad u otros factores limitan su aplicación; - = no adecuado para esta finalidad. PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de bengala] y BPAT [prueba de aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA = enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina; SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 19 �a Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por Brucella. b Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/ manadas, se recomienda combinar pruebas para aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o I- ELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST. c En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal. En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso en ausencia de signos clínicos. En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o BST. En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST. d Es posible que se obtenga falsos positivos. e En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev. 1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección. f Solo ganado lechero. Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y rechazo de muestras. Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta identificación, embalaje y documentación que acompaña a las mismas. Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con back- up), en el que figure como mínimo la siguiente información: • Fecha de recepción de muestras. • Cantidad de muestras. • Especie. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 20 �• Fecha de extracción de muestras. • Procedencia: establecimiento, número de Renspa. • Localidad: departamento, partido, provincia. • Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa. • Motivo del envío: • DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario). • MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus). • SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el Movimiento). • Control interno (según requerimiento de veterinario acreditado). • Remuestreo, otros. Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras: • Sangre entera o suero refrigerados • Suero congelado • Leche para PAL refrigerada (no congelada) • Leche para IELISA refrigerada/congelada • Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo • Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras: • Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) • Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la toma de muestra • Sangre entera congelada • Leche para PAL congelada, contaminada • Sangre entera o suero, contaminados • Sueros hemolizados • Tubos no identificados • Volumen insuficiente Los laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 21 �Informes de resultados Los informes que elabore el laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar adecuadamente las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo I del presente manual). En el informe de resultados debe constar: • Logo del laboratorio/Dirección/Tel./e-mail/ Número de identificación del laboratorio • N.° de protocolo interno • Fecha de extracción de muestras • Fecha de recepción de muestras • Fecha de informe o emisión de resultados • Cantidad de muestras • Especie • Procedencia: establecimiento, número de Renspa • Localidad: Departamento, partido, provincia • Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa • Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus), SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el movimiento), control interno (según requerimiento de veterinario acreditado), remuestreo • Columnas con la información del tubo / caravanas / edad / fecha de vacunación / pruebas utilizadas / resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME, ELISA, FCT, FPA), valor de corte e interpretación cuando corresponda • Información de los antígenos / kits utilizados • Firma del director técnico del laboratorio • Observaciones • Paginación x de y • Que conste en todas las páginas N.° del protocolo y N.° de Renspa Animales para examinar: Hembras vacunadas mayores de 18 meses y animales no vacunados mayores de 6 meses. Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de brucelosis en la República Argentina. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 22 �Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos IgM específicos. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio marcada con cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente. • La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para evitar la evaporación de las muestras. • Mezcladores de acero o plástico. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 º C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 ° C). • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. Reactivos: • Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%. • Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%. • Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Suero control interno positivo. • Suero control interno negativo. • Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Ejecución del ensayo de BPAT • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). • Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de ambos lados de la misma. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 23 �• Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 µl de suero, previo mezclado con vórtex. Utilizar un tip o punta de pipeta para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno. • Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro. • Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeneizar la mezcla. • Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa, permaneciendo la luz apagada. • Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos. A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura. Figura 2: Aglutinoscopio. Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala • Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT. • Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 µl de suero. Utilizar un tip para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero. • Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno, abarcando una superficie circular de aproximadamente 2 cm de diámetro. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 24 �• Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente. • Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco. En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OMSA recomienda utilizar la prueba de Rosa de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno. Lectura a los 4 minutos, como se detalla en la explicación anterior. Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aun siendo finos (no confundir con aglutinaciones inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de SAT / 2-ME, FPA, ELISA o FCT. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos. Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias. + - + Figura 3: Lectura BPAT/RBT - Informes de resultados Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas: Positivo Negativo + - POS NEG P N MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 25 �Criterios de aceptación del resultado En paralelo a las muestras problema se dispensan los sueros controles internos negativos y positivos. Para aceptar los resultados, ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si los controles no arrojan la lectura esperada, se deben revisar las posibles causas, calidad de los sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc. Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión. El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que causa un determinado grado de aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución. La prueba de 2-mercaptoethanol (2-ME) es una prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2-mercaptoethanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aun cuando las subunidades están integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación. La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos de la clase IgG. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente). El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de vidrio. • Probetas (100 ml y 1000 ml). • Pipetas 1, 2, 5 y 10ml. • Recipientes de vidrio de volúmenes variados. • Propipetas. • Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10 ml. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 26 �Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Balanza. • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. • Termómetro calibrado. Reactivos: 1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%.4 2. Suero control interno positivo. 3. Suero control interno negativo. Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Drogas y soluciones5: • Cloruro de sodio p.a. • Fenol p.a. • 2-mercaptoethanol p.a. • Solución salina al 0,85 %. • Solución salina fenolada al 0,5 %. Ejecución del ensayo Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera: • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC al menos una hora antes de la ejecución del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos de 10 minutos (no usar vórtex). • Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8 tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla con el número de protocolo. • Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema. En los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja un espacio libre y en los 4 tubos siguientes de la misma hilera, se realiza la prueba de 2-ME. • Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer tubo, 40 µl se distribuyen en el segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el cuarto. • Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de suero en los tubos de 2-ME. 4 Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar porque esto lo inutiliza al modificar la sensibilidad. 5 Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 27 �• Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo, además de un control de soluciones y antígeno sin suero. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución de 2-ME (0,1 M) en cada tubo de este grupo y mezclar muy bien agitando la gradilla. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución salina fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT. • Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y, posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno de SAT diluido al 2 % (0,09 % de brucelas) en solución salina 0,85 %. • Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa. Consideraciones generales: • Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse por las técnicas de SAT y 2-mercaptoethanol, ELISA, FPA o FCT. • La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación en tubo, no solo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción de la aglutinación específica de la unión antígeno-anticuerpo. Incubación La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 horas y tiene por objeto obtener en el tiempo más corto posible el máximo de aglutinación. Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la estufa durante el transcurso de las 40-48 horas de la incubación, para verificar la estabilidad de la estufa. Lectura e interpretación de resultados Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las pruebas contra el fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz que atraviese los tubos. La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el fondo del tubo por gravedad determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo; después de una leve agitación del tubo, se mantienen los grumos firmes. La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar tanto en la claridad/turbidez de las MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 28 �mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los grumos al agitar suavemente el tubo. El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa aglutinación en el tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la turbidez y los grumos firmes se mantienen a pesar de una agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI / ml de aglutinación en SAT o en 2-ME. El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo (+), incompleto (I) o negativo (-). • Aglutinación completa es aquella en que el líquido de la mezcla suero-antígeno aparece límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos. • Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una suave agitación no rompe los grumos. • Negativa es aquella en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida aparece turbia y una suave agitación no revela grumos. Fenómeno de zona En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas, pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada “fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el suero en las diluciones más bajas, lo que provoca una aglutinación no visible por estar fuera de la zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 29 �Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME. Informes de resultados Ejemplo: Negativo Neg I 25 25 1/25 I: Incompleto Tabla 2 Interpretación de los resultados para hembras bovinas mayores de 18 meses de edad vacunadas con Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH * NH NEGATIVO + ≤ 50 - NEGATIVO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - SOSPECHOSO + I 200 - SOSPECHOSO + 200 - POSITIVO + 25 a 50 I 25 NEGATIVO + ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO + ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO * NH: No se hace MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 30 �Tabla 3 Interpretación de los resultados para animales no vacunados (bovinos y otras especies) mayores de 6 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH NH NEGATIVO + 25 - NEGATIVO + I 50 - SOSPECHOSO + 50 - SOSPECHOSO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - POSITIVO + 200 - POSITIVO + ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Solución salina 0,14 m • Cloruro de sodio 8,5 g • Agua destilada 1000 ml Solución salina fenolada Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. Solución 2-ME 0,1 m • 2-Mercaptoethanol 7,8 ml • Solución salina 0,14 M. 992,2 ml Importante: no utilizar solución salina fenolada El 2-mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire. Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en lo posible con máscara de gases o en cabina de extracción. Nunca pipetear con la boca. La solución de 2-mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una semana a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. • Solución de antígeno SAT (wright) al 2 % • Solución salina 0,14 M (no utilizar solución salina fenolada) 98 ml • Antígeno SAT (wright) (4,5 %) 2 ml MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 31 �La solución de antígeno al 2 % se puede conservar por una semana en heladera (5 ± 3 ºC). Descartar toda aquella solución que presente turbidez o signos de contaminación. Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos La prueba se diseñó para detectar la presencia de anticuerpos en leche de bovinos. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie, de esta manera forma una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural. Esta prueba se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la brucelosis. El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso. Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las pruebas serológicas para identificar aquellos infectados. Desarrollo Materiales: • Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de Khan de vidrio claro y completamente limpio. • Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. • Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml. • Gradillas. • Timer. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Termómetro calibrado. Reactivos: • Antígeno PAL con volumen celular aprox.4 %. • Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Muestras de leche refrigerada (no congelada). • Solución de formalina 1 %. • Muestras de leche controles positivo y negativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 32 �Ejecución del ensayo Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura de 5 ± 3 ºC hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas). No deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta ni conservadas durante más de 72 horas. • Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (no usar vórtex). • Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100 mm o tubo de Khan. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. • Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes. • Incubar en estufa a 37 ± 2 º C, durante una hora. Lectura - Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul. + Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual. ++ Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche. +++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color. ++++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca. Cualquier grado de + debe interpretarse como positivo. Observaciones • El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba. También, la agitación vigorosa dificulta su realización. • El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba no se puede efectuar con leches pasteurizadas. • Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la leche, se pueden obtener algunos resultados falsos positivos o dudosos. • La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos. • La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la interpretación de la prueba debido al descoloramiento del antígeno. • La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos positivos. • Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 33 �Modificación de la prueba para tanques muy grandes Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche manteniendo constante la cantidad del antígeno (30 µl). Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (2 o 3 ml de leche), se añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada al tubo de ensayo y, a continuación, 30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la misma forma que para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis. < 150 vacas 1 ml de leche 150 – 450 vacas 2 ml de leche 451- 700 vacas 3 ml de leche Figura 5: Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras de pool de leche. Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis en la República Argentina con el valor de corte establecido por el Senasa. El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de “señal” que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 34 �hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular. Etapas Previo al inicio de la ejecución del ensayo, equilibrar todos los componentes del kit a temperatura del laboratorio. 1. Adición en cada pocillo de los controles y sueros/leche problemas en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos, estos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 2. Incubación. 3. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o uniones inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del ensayo. 4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti IgG de especie), los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 5. Incubación. 6. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado. 7. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 8. Adición de la solución de frenado. 9. Lectura colorimétrica de la placa. Figura 6: Esquema ELISA indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 35 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450 nm). • Computadora. • Agitador orbital de placas. • Lavador manual o automático de placas. • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 ºC). • Estufa de incubación (37 ± 2 ºC). • Vórtex. • Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada). • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10 µl, 5 - 50 µl, 50 -200 µl, 200 - 1000 µl). • Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl). • Propipetas. • Dispensadores automáticos. • Timer. • Selladores de placas de acetato o parafilm. • Cubetas plásticas para pipetas multicanales. • Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o placas fondo en U. • Criotubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros. • Gradillas. • Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc., de distintos volúmenes). • Toallas o papel absorbente. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa y contienen: • Buffer de lavado • Buffer de dilución • Conjugado • Sustrato cromógeno • Solución de frenado • Sueros controles • Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 36 �Precauciones para tener en cuenta al ejecutar la técnica de Elisa: • Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos. • Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de su utilización. • No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits. • Evitar cualquier contaminación de los reactivos. • No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad. • Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo. • Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación / dilución de los reactivos que se empleen en el ensayo. • Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo. • Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador. • Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice el kit. • El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se recomienda retirar del frasco únicamente el volumen que se vaya a utilizar y nunca devolver el sustrato sobrante al frasco original. • La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la piel lavar inmediatamente con abundante agua. Figura 7: Placa de Elisa. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 37 �ELISA por competición / bloqueo La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una matriz sólida (microplaca de 96 pocillos). A continuación, se añade la dilución de los sueros y el anticuerpo monoclonal, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos junto con el antígeno adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo antimonocolonal conjugado con enzima. Es importante mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero normal (no infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies. La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato/cromógeno. Después de un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos del ensayo la placa debe ser lavada debidamente. En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el anticuerpo monoclonal se liga con el epitope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos anti Brucella (suero positivo), estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epitope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos posvacunales por B. abortus cepa 19 compiten en menor grado con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja, lo que usualmente resulta en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores al sangrado). Diversos CELISA/bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras contengan anticuerpos frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen este tipo de anticuerpos, el conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa. Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato adecuado, el cual desarrollará una reacción colorimétrica en presencia de la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con enzima). De este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra evaluada no contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y la ausencia de color indicará que la muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos. Desarrollo Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación de las muestras: Idem Elisa indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 38 �Figura 8: CELISA. Tabla 4 Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA Señal Posible causa Solución 1. Error de pipeteo 2. Falta de mezcla de reactivos 3. Falta de lavados Práctica Mejorar técnica Precaución 1. Se omitió el substrato 2. Concentración substrato errónea Revisar Revisar 3. Conjugado muy diluido 4. Se omitió el conjugado Revisar Revisar Color parejo en toda la placa 1. Conjugado muy concentrado 2. Falla en el lavado 3. Substrato contaminado Controlar Mejorar técnica Revisar Elevado color de fondo “background” 1. Reacción inespecífica 2. Material de vidrio sucio 3. Agua de mala calidad Cambiar solución de lavado Mejorar lavado Controlar calidad Desarrollo de color muy rápido 1. Substrato muy concentrado 2. Conjugado muy concentrado Revisar Controlar dilución Desarrollo de color muy lento 1. Substrato muy diluido 2. Conjugado muy diluido 3. Concentración cromógeno errónea Revisar Revisar dilución Revisar Efecto borde 1. Incubación despareja 2. Resecación por aire 3. Tampón de lavado residual Utilizar estufa Mantener la placa cubierta Eliminarlo Color irregular No hay color MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 39 �Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 40 �Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero El ensayo de polarización fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella tiene la capacidad de ser una prueba multiespecies, lo que permite el diagnóstico presuntivo en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y bisontes. Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con Brucella de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de los 3 meses posvacunación aproximadamente, y de los animales con reacción cruzada con bacterias gramnegativas en más del 90% de los casos. A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un tubo de vidrio. A continuación, la muestra es equilibrada por aproximadamente cinco minutos, posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador fluorescente para obtener una lectura blanco de referencia (autofluorescente). A continuación, el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) es agregado a la solución y luego la muestra es equilibrada nuevamente por un mínimo de dos minutos para permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen. La muestra es leída nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos anti Brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP. El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina se ha determinado en: Bovinos: • Animales negativos: < 94 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 94 mP y 104 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP. Caprinos y porcinos: • Animales negativos: < 85 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 85 mP. Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis): • Animales negativos: < 80 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 80 mP y 90 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 91 mP. Se modifica el valor de corte en la especie ovina (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis) con una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 95 %. Programa GraphPad Prism. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 41 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de polarización fluorescente. • Vórtex. • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10 µl, 20 –200 µl, 200– 1000 µl). • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 º C). • Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm. • Material de vidrio. • Termómetro de temperatura ambiental. • Computadora e impresora. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa e incluyen: • Buffer de dilución. • Sueros controles positivo y negativo. • Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceína. Ejecución del ensayo Preparación de los reactivos Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial. Preparación del equipamiento/instrumentos El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos los equipos previos a la ejecución del ensayo. Preparación de la prueba En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con lo especificado en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los sueros controles no se ajusta dentro de los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado. Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por lo menos dos (2) horas antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso: • Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 10 µl de suero bovino (dilución 1/100) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex evitando la formación de espuma. • Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex. • Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros. • Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 42 �• Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se estabilice. • Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las muestras. • Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y mezclar bien con vórtex. Es importante evitar la formación de espuma en la muestra. En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas partículas hayan sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas pueden interferir con la lectura de la muestra dado que la misma se basa en el peso molecular de las partículas en suspensión. • Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos minutos. • Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas. Figura 10: Esquema ensayo de polarización fluorescente. Lectura e interpretación Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del kit utilizado según el control de calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo. Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización (mP) de la actividad del suero contra el antígeno. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Aceptación de los controles Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será rechazada y los controles y las muestras deben ser repetidas. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 43 �Fijación de complemento La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional para el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina. La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos “capaces de fijar” el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de “Animal infectado”. La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente. La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera, el antígeno y el suero problema (cuyo complemento se destruyó previamente por calentamiento a baño maría) se incuba en presencia de complemento de cobayo. Después de dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un “sistema indicador” o “sistema hemolítico” formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como complejo antígeno-anticuerpo alternativo. La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmunocomplejos en la primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de sus factores. En la segunda etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante la presencia del “sistema hemolítico”. El resultado es la ausencia de hemólisis (resultado positivo). Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es indicadora de la existencia de complemento libre en la segunda etapa de la reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmunocomplejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo). Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2 %, 2,5 % o al 3 %). Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina) hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100 % de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo. Desarrollo Materiales: • Tubos de ensayo. • Material de vidrio de volúmenes varios. • Gradillas. • Film para cubrir placas. • Puntas de pipetas (tips). • Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. • Cubetas o reservorios de plástico para reactivos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 44 �Equipos: • Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a 5000 µl. • Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl. • Centrífuga. • Centrífuga de placas. • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 °C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Agitador de microplacas. • Vórtex. • Baño térmico. • Espectrofotómetro. Reactivos: • Solución buffer: Ver Anexo FCT I Solución GR 2%: ver Anexo FCT II Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III Sistema hemolítico Anexo FCT IV • Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V Titulación Antígeno: Ver Anexo FCT VI Sueros controles: • Suero control positivo bovino. • Suero control negativo bovino. Manejo y conservación de las muestras • Conservar los sueros en heladera (5 ± 3 º C) no más de dos días, para períodos mayores, conservarlos a –20 ± 5 º C. • Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento. • No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis. • Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos. Inactivación de los sueros Los sueros controles y las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2 ºC para eliminar el complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño termostático se controla mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de exposición de las muestras. - Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre 60 - 63 °C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación de 30 minutos). - Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. Volumen de suero sugerido para inactivar: 200 µl. - La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejan a tem- MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 45 �peratura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 horas, las muestras ya inactivadas se conservan a -20 ± 5 ºC. Condiciones del ensayo El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2 º C) y se utilizan los siguientes reactivos en volúmenes de 25 µl: a. Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB. b. Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100 %). c. Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo. d. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una solución de suero hemolítico en SB que contenga 2UH (100 %) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero en SB al 2 %. Ejecución Dependiendo del número de muestras que se realizarán, se podrán incluir los controles en la misma placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles. Dilución de las muestras de suero El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U, mediante la utilización de volúmenes de 25 μl. La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Suero 25 µl 25 µl de la dilución 1/2 25 µl de la dilución 1/4 25 µl de la dilución 1/8 25 µl de la dilución 1/16 25 µl de la dilución 1/32 25 µl de la dilución 1/64 25 µl de la dilución 1/128 SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl Sueros controles Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización de volúmenes de 25 μl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla en la tabla 2. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 2 1/12,5 1/25 Suero positivo 01/05 25 µl SB - 25 µl 25 µl 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 25 µl de la dilución 1/25 25 µl de la dilución 1/50 25 µl de la dilución 1/100 25 µl de la dilución 1/200 25 µl de la dilución 1/400 25 µl de la dilución 1/800 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 46 �Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.). Controles del ensayo a. Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado en la placa 25 μl/pocillo de SB, 25 μl/pocillo de C y 25 μl/pocillo de antígeno. b. Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 50 μl/pocillo de SB y 25 μl/pocillo de C. c. Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 75 μl/pocillo de SB. Disposición de los sueros en la placa Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo en U (25 µl/pocillo) según indica la tabla 3. Tabla 3 1 Control positivo 2 Control negativo 3 muestra 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/12,5 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 B 1/25 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 C 1/50 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 D 1/100 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 E 1/200 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 F 1/400 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 G 1/800 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 H 1/1600 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento • Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras. • Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control negativo) y 1/12,5 (control positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder anticomplementario (PAC) de cada suero. Primera incubación en caliente • Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Dispensado del sistema hemolítico • Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e incubar a 37 ± 2 ºC durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo FCT IV. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 47 �• Finalizada la primera incubación, dispensar 25 μl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los pocillos de las placas incluida la placa de los controles. Segunda incubación en caliente • Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos o bien dejarla en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura. Lectura de resultados El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos) de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción positiva se cuantificará mediante la determinación del título y su grado de hemólisis. Reacción positiva • Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo. • El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y consignarse mediante un sistema de cruces. Figura 11: Placa fijación de complemento. ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botó de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 48 �Determinación del título del suero Será la inversa de la dilución más alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este grado de fijación será informado mediante el sistema de cruces descripto y convertido a UIFCT. - En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier valor ≥ 40 UIFCT (1/8 ++). - Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo cualquier valor ≥ 20 UIFCT (1/4 ++). Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón internacional OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se basa en el “Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis” (Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia) y el “Manual de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario” (Gobierno de Aragón. España. Tabla 4). Tabla 4 Interpretación en UIFCT Dilución % de Fijación del Complemento 1000 UIFCT (1/200) + ++ +++ ++++ 16,6 20 23,2 26,6 1:8 + ++ +++ ++++ 33,2 40 46,4 53,2 1:16 + ++ +++ ++++ 66,4 80 92,8 106,4 + ++ +++ ++++ 132, 8 160 185,6 212,8 1:64 + ++ +++ ++++ 265,6 320 371,2 425,6 1:128 + ++ +++ ++++ 531,2 640 742,4 851,2 + ++ +++ ++++ 1062,4 1280 1484,8 1702,4 1:4 1:32 1:256 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 49 �Controles del ensayo La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados: Controles Resultado esperado Suero control positivo 50 % de fijación (++) en la dilución 1:200 que corresponde a 1000 UIFCT (Brucellas lisas) Suero control negativo 100 % de hemólisis en todos las diluciones, ausencia de fijación de complemento Control de poder anticomplementario de los sueros 100 % de hemólisis ausencia de fijación del complemento en la dilución 1:2 (sin antígeno) Control de ausencia de poder anticomplementario del antígeno 100 % hemólisis Control del sistema hemolítico sin C 0 % de hemólisis Control del sistema hemolítico con C 100 % de hemólisis Criterio de aceptación del análisis: El ensayo se debe considerar APROBADO/NO APROBADO a) APROBADO: • Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento dan los resultados pre-establecidos. • El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con una variación máxima de (± 2 ++). • El control negativo da un resultado Negativo. b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se repite el ensayo. La presencia de, al menos, un 25 % de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A (dilución ½) indica poder anticomplementario en la muestra. En este caso, se informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción de la toma de muestra. Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar una escala visual del siguiente modo: • En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 900 µl de SB 1X. • En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 700 µl de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR (solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X para mantener la presión osmótica. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 50 �Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0 % de hemólisis y el 100 % de hemólisis en la prueba. De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS Reactivos en µl 0% Solución hemolisada Suspensión de glóbulos rojos 0 100 10 % 10 90 20 % 20 80 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % 80 % 90 % 30 40 50 60 70 80 90 100 60 50 40 30 20 10 0 70 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 100 % 51 �Anexos MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 52 �Anexo FCT I: Solución Buffer (SB) Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1, luego conservar en refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez producto de contaminación. Solución de stock calcio 0,3 M y magnesio 1 M Ca Cl2. Mg 3,7g Cl2. 9,5 g Agua destilada 100 ml • Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85 % (NaCl2 8,5 g/agua destilada 1 litro). • La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 - 7,4. • Luego de su uso, conservar en refrigeración por 7 días. II: Preparación de la suspensión de GR 2 % a) Lavado de los GR 1. Homogeneizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos. 2. En un tubo cónico resuspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5 volúmenes de SB, luego homogeneizar cuidadosamente. 3. Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 4. Repetir la resuspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente descripta y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 5. Realizar la última resuspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 10 minutos. 6. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante, el cual debe estar libre de hemólisis. 7. El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2 % se podrá realizar por medio de dos técnicas. • Método espectrofotométrico. • Método en cámara de Neubauer. Método espectrofotométrico: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5 ml agua destilada en la celda o tubo del espectrofotómetro. 3. Determinar la lisis 100 % de los GR realizando una dilución 1/15 con agua destilada, agregando en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 53 �4. Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm. 5. La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar según el modelo de espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la concentración de GR al 2 %. Método en cámara de Neubauer: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlos en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la cámara. 3. La suspensión deberá tener 5,4 (± 0,2) X 108 GR / ml. III: Titulación Hemolisina Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex. Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina N.° de tubo Dilución SB (ml) Hemolisina 1 1/50 4,9 100 µl 2 1/100 2 2 ml T1 3 1/150 7,45 50 µl 4 1/200 1 1 ml T2 5 1/250 12,5 50 µl 6 1/500 1 1 ml T5 7 1/1000 6 2 ml T5 8 1/2000 1 1 ml T7 9 1/3000 2 1 ml T7 10 1/4000 3 1 ml T7 11 1/5000 4 1 ml T7 12 1/6000 5 1 ml T7 13 1/7000 3 0,5 ml T7 14 1/8000 3,5 0,5 ml T7 15 1/9000 4 0.5 ml T7 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 54 �Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina • En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo de SB excepto de las columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2). • En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la batería de tubos de ensayo, según protocolo de la tabla 1. • Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se realiza mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl / pocillo de la fila B y pasar a la fila. • Volver a homogenizar. Recoger 25 µl / pocillo de la fila C y pasar a la D. Homogeneizar y recoger 25 µl / pocillo y descartar. • De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H. • Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 550 µl 50 µl 50 µl de T1 de T1 de T1 de T2 de T2 de T3 de T3 de T4 de T4 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 10 11 12 E F G H 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T5 de T5 de T6 de T7 de T8 de T9 de T10 de T11 de T12 de T13 de T14 de T15 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS SB 55 �Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/50 1/50 1/100 1/100 1/150 1/150 1/200 1/200 B 1/100 1/100 1/100 1/200 1/200 1/300 1/300 1/400 1/400 C 1/200 1/200 1/200 1/400 1/400 1/600 1/600 1/800 1/800 D 1/400 1/400 1/400 1/800 1/800 1/1200 1/1200 1/1600 1/1600 F 1/250 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/3000 1/4000 1/5000 1/6000 1/7000 1/8000 1/9000 G 1/500 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/6000 1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000 H 1/1000 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000 E Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos Se prepara una suspensión de GR al 2 % según lo indicado anteriormente. En este ensayo se prepara una suspensión de 5 ml. 1. Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca. 2. Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos a bajas revoluciones. Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión con los anticuerpos presentes en las diluciones de hemolisina). 3. Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se dispensan adicionalmente otros 25 µl (esta columna actúa como control del poder hemolítico de la hemolisina). Preparación y dispensado de una solución de complemento El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que siempre haya reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) Ac (hemolisina diluida). Para complementos (comerciales) que den un título (unidad de complemento) superior a 1/90, debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que den títulos inferiores, la solución que se deberá preparar será de 1/10 - 1/20 (tabla 4). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 56 �Tabla 4: Dilución del complemento TV Complemento Solución de complemento 1/20 5,7 ml 0,3 ml Solución de complemento 1/30 5,8 ml 0,2 ml 1. Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C, D, F, G y H, excepto en los pocillos de la columna 1. 2. Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Incubación Incubar a 37 ± 2 ° C, durante 30 minutos. Cálculos y expresión de resultados El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consigna mediante un sistema de cruces (tabla 5). Tabla 5: Expresión de resultados ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente. Cálculos de los resultados • Se define la unidad de hemólisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. • Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de hemólisis presentan un grado de hemólisis similar. • Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor concentración de hemolisina). • La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir 2 UH 100 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 57 �Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000 DT= 2 x 1/1000= 1/500 • Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas de trabajo. • Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5 º C para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote, fecha y cantidad de hemolisina diluida. IV: Sistema hemolítico • Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema depende del número de placas que se deberán utilizar (1 placa= 96 pocillos fondo en U). Ejemplo para dos placas: 2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de perdidas) • Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2 % y luego 2,5 ml de hemolisina al título de uso agitando suavemente para homogenizar las dos suspensiones e incubar a 37 ± 2° C, durante 15 minutos. V: Titulación complemento Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema enzimático denominado ‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de fijación del complemento es la de detectar uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean glóbulos rojos, es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la reacción de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el papel de antígeno y el suero de conejo (hemolisina) de anticuerpos. El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo llevar a temperatura de laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacará de la heladera en el momento de su utilización. Si se prevé que se va a utilizar más de un vial, se juntarán todos en uno y se titulará el conjunto. Preparación de las soluciones “madres” del complemento 1. Realizar 6 diluciones “madres’’ del complemento, empleando para ello tubos de ensayo. Tabla 1 de este anexo. 2. En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se homogeneiza perfectamente mediante un agitador. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 58 �Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 SB µl 725 850 975 1100 1225 1350 C µl 25 25 25 25 25 25 Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB 1. En la filas B, C y D de una placa fondo en U, dispense 25 µl/pocillo de SB (tabla 2). 2. En la filas A de la placa, dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de complemento por duplicado según protocolo descripto en tabla 1. 3. Con una pipeta multicanal, recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a la fila B. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se propiciará mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensación de la pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila. 4. Vuelva a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogenice y recoja 25 µl/pocillo y descártelos (las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3). 5. Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa. 6. Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB E F G H MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 59 �Tabla 3. Diluciones finales del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 B 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 C 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 D 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 E F G H Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 15 minutos. Dispensado del sistema hemolítico El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto anteriormente. 1. Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl / pocillo del SH en todos los pocillos de la placa. 2. Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. 3. Incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 60 �Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces: Tabla 4 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de complemento (UC) o unidad hemolítica como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UC con la dilución más alta que de 100 % de hemólisis. 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC. Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el análisis de 2 placas según el procedimiento descripto. Ello supone un volumen total de solución de complemento de 2 placas x 2,4ml / placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de pérdidas). a. Supongamos que UC = 1/100 DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50 Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro: En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml b. Por tanto las proporciones serán: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml de SB. Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 61 �Control de dos unidades de complemento (2 UC) Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizarán diluciones del complemento que contengan 2 unidades; 1,5 unidades; 1 unidad; 0,75 unidades y 0,5 unidades. Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia (tabla 5). Tabla 5. Diluciones del complemento Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 Se dispensarán por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en los correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de SB (tabla 6). Tabla 6. Unidades del complemento en la placa 1 2 3 4 5 A 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U B 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U 6 7 8 9 10 11 12 C D E F G H 1. Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2-4 minutos e incube en estufa a 37 ± 2 ° C durante 15 minutos. 2. Luego repita lo descripto agregando el SH Lectura del análisis: • Pocillo con 2 unidades: 100 % de hemólisis • Pocillo con 1,5 unidades: 100 % de hemólisis MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 62 �• Pocillo con 1 unidades: 100 % de hemólisis o traza de GR en suspensión • Pocillo con 0,75 unidades: 0 % a 75 % de hemólisis • Pocillo con 0,5 unidades: 0 % a 50 % de hemólisis Control de calidad El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un grado de reacción similar. En caso contrario se repetirá el análisis. Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el 100 % (N) de hemólisis (las más bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de hemólisis (las más alta). En caso contrario se repetirá el análisis. En el control de 2 unidades de complemento deben dar los resultados preestablecidos. El análisis debe informarse como APROBADO / NO APROBADO en el apartado de observaciones de la planilla de titulación del complemento. En caso de no aprobado, se repite el proceso. VI: Titulación antígeno Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 %. Se trata de determinar lo que se denomina UA (unidad antigénica) que corresponde para cada lote de antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los sueros problema, en la cantidad suficiente para fijar el complemento. El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros problema y que serán capaces de fijar el complemento. Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento. Preparación de diluciones “madre” de antígeno Se preparan tres diluciones previas en tubos, luego se dispensarán: • en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un tercer tubo 1250 µl de SB y 10 µl de antígeno. Esto da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125, respectivamente. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 63 �Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno En una placa de fondo en U se dispensan 25 µl de SB en todos los pocillos salvo en la columna 1 y los pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizarán hasta la columna 9 (tabla 1). En la columna 1 se pondrán 50 µl de las soluciones madres del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de forma simple (tabla 1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la columna 1 a la columna 9 y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10, H11 y H12. Es decir, se pasan 25 µl de la columna 1 a la 2, se homogeniza y se pasan otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente, y se eliminan los 25 µl que sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12. Tabla 1. Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno 1 2 3 4 5 6 7 A 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 B 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 8 9 10 11 12 1/6400 1/12800 1/50 1/75 1/125 1/6400 1/12800 1/100 1/150 1/250 1/200 1/300 1/500 C D 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/400 1/600 1/1000 E 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/800 1/1200 1/2000 1/1600 1/2400 1/4000 1/8000 F G H 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/3200 1/4800 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/6400 1/9600 1/16000 Dispensado de sueros controles positivo y negativo Seguidamente se dispensan 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la fila A, B, D, E, G y H salvo en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl de suero control negativo y servirá como control de hemolisis. El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en la reacción de fijación del complemento. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 64 �Dispensado de una solución de complemento Posteriormente se dispensan 25 µl de complemento a todos los pocillos según el título obtenido previamente. Se agita la placa 2-4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37 ± 2°C. Dispensado del sistema hemolítico Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos. Luego se agita la placa 2-4 minutos e incubará durante otros 30 minutos a 37 ± 2°C. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces. Tabla 2 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un depósito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un depósito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un depósito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 65 �Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación completa (0 % de hemolisis). 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de antígeno presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor concentración de antígeno). 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA. Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800: DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 66 �Anexo I Modelo de planilla de emisión de resultados MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 67 �Bibliografía MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 68 �Normativa vigente Ley 24.696 de año. Por la cual se declara de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio Nacional. 26 de septiembre de 1996. B.O. N.º 28.492. Norma Organización Internacional de Normalización [ISO/IEC 17025]. 2017 (España). Resolución 957 de 2024 [Senasa]. Por la cual se aprueba el uso de los inmunógenos RB51 y Delta PGM. 15 de agosto de 2024. Resolución 276 de 2023 [Senasa]. Por la cual se adopta el sistema de diagnóstico serológico para el Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la República Argentina. 14 de abril de 2023. Resolución 77 de 2021 [Senasa]. Por la cual se sustituye el articulo 9° y 10 de la Resolución N.° 67/19 y otras modificaciones. 19 de febrero de 2021. Resolución 67 de 2019 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional De Control y Erradicación De Brucelosis Bovina en la República Argentina, de aplicación obligatoria en todo el territorio nacional, excepto en la provincia de Tierra Del Fuego, Antártida e islas del Atlántico Sur. 1.° de febrero de 2019. Resolución 857-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se declara como zona libre de brucelosis ovina y caprina a Brucella melitensis, a la región patagónica y se establece el Programa De Vigilancia y Prevención. 27 de diciembre de 2017. Resolución 372-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional de Control de Brucelosis Caprina en la República Argentina y se establecen las estrategias sanitarias básicas que deben ser aplicadas en cada zona o provincia. 14 de junio de 2017. Resolución 98 de 2016 [Senasa]. Por la cual se resuelve la comercialización de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis.18 de marzo de 2016. Resolución 63 de 2013 [Senasa]. Por la cual se crea el Registro Nacional de Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina. 28 de febrero de 2013. Resolución 246 de 2007 [Senasa]. Por la cual se aprueban los requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se dediquen a la elaboración de productos destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis Animal y la Tuberculosis Animal. 04 de mayo de 2007. Resolución 438 de 2006 [Senasa]. Por la cual de adopta el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. 4 de agosto de 2006. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 69 �Resolución 736 de 2006 [Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos]. Por la cual se crea la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. 17 de noviembre de 2006. Resolución 79 de 2003 [Senasa]. Por la cual se aprueba el procedimiento para la supervisión de la aplicación de los tratamientos de fumigación oficial. 26 de enero de 2003. Resolución 1484 de 1993 [Senasa]. Por la cual se establecen las normas para la elaboración, fraccionamiento, distribución, expendedor para los reactivos destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal. 28 de diciembre de 1993. Bibliografía consultada Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D. and Verger, J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. INRA, Paris. Angus, R.D. & Barton, C.E. (1984). The production and evaluation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand. (56,349-356). Centro Panamericano de Zoonosis (1968). Técnicas e interpretación de sero-aglutinación para el diagnóstico de la brucelosis bovina. Nota Técnica Nº2. Ramos Mejía. Ciocchini A.E., Rey Serantes D. A., Melli L.J., Iwashkiw J.A., Elena S., Franco C., Nicola A.M., Feldman M.F., Comerci D.J., Ugalde J.E. (2014) A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigenic target for diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol. 172 (3-4):455-65. Cortina M.E., Balzano R.E., Rey Serantes D.A., Caillava A.J., Elena S., Ferreira A.C., Nicola A.M., Ugalde J.E., Comerci D.J., Ciocchini A.E (2016). A bacterial glycoengineered antigen for improved serodiagnosis of porcine brucellosis. Journal of Clinical Microbiology. 54(6), 1448-1455. Gall D., Nielsen K., Forbes L., Cook W., Leclair D., Balsevicius S., Kelly L.,Smith P. & Mallory M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37,110-118. Gall D.,Nielsen K.,Forbes L.,Davis D.,Elzer P.,Olsen S.,Balsevicius S.,Kelly L., Smith P., Tan S. & Joly D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J. Wildl. Dis., 36, 469-476. Bagnat, Moras, Vibot, Samartino, T. De Echaide, Walsh, Diprodesa, Di Lorenzo, Nicola (2006). Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis. Macmillan A.P., Greiser-Wilke I., Moennig V. & Mathias L.A. (1990). A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. DtschTierarztl. Wochenschr. (97, 83-85). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 70 �Lucero, N., Escobar, G., Ayala, S., Hasan, D. (2008). Manual de Procedimientos Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana. Servicio de Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”, Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur, Buenos Aires. Nielsen K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol. (90,447-459). Nielsen K., Gall D., Jolley M., Leishman G., Balsevicius S., Smith P., Nicoletti P. & Thomas F. (1996). A homogenous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus. J. Immunol. Methods (195,161-168). 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Clin. Diag. Lab. Immunol. (7, 828-831). Stack J.A., Perrett L.L., Brew S.D., Macmillan A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples. Vet. Record (145, 735-736). Szyfres, B. (1983). El Diagnóstico de la brucelosis bovina en el contexto de un programa de lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA. Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone, A., Marchesino, M., Nielsen, K. (1998). Evaluation of an Indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet. Med. (36, 211-217). Vanzini, V., Echaide, S., (1998). Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar anticuerpos anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos obtenidos en la EEA Rafaela. World Health Organization (2005). Laboratory Biosafety Manual. Second Edition. Geneva. World Health Organization (1986). Joint Food And Agriculture Organization Of The United Nations/World Health Organization Expert Committee On Brucellosis. Technical Report Series 740, Sixth Report. Geneva. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 71 �World Organisation for Animal Health (2022). Manual of standards for diagnostic test & vaccines. Brucellosis (infection with Brucella abortus, B. melitensis and B. suis). Wright P.F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev.sci.tech., (12, 435-450). Wright P.F., Tounkara K., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1997). International reference Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech. (3, 824-832). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 72 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de procedimiento. Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0177 Abstract A summary of the resource. El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Técnicas reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Incluye nociones sobre medidas de bioseguridad y controles de calidad a aplicarse en los procedimientos técnicos de laboratorio. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivos Abreviaturas y definiciones Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Principios de bioseguridad Prácticas operativas seguras y hábitos personales Limpieza y desinfección del laboratorio Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Control de calidad de insumos Equipos Sobre la enfermedad Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino Infección por Brucella en ovejas y cabras Infección por Brucella en cerdos Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo Ejecución del ensayo de BPAT Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Desarrollo Ejecución del ensayo Incubación Lectura e interpretación de resultados Informes de resultados Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos Desarrollo Toma de la muestra Ejecución del ensayo Lectura Modificación de la prueba para tanques muy grandes Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Etapas Desarrollo ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero Desarrollo Ejecución del ensayo Lectura e interpretación Fijación de complemento Desarrollo Manejo y conservación de las muestras Condiciones del ensayo Ejecución Lectura de resultados Anexos Bibliografía Brucelosis Laboratorios https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/35eda3021c8fb4a8a2380759c0674b74.pdf 6c70debf728306ca233e15a22a0148d6 PDF Text Text INSTRUCTIVO Renspa: Inscripción y actualización de datos 100% online Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Edición 2025 INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 2 �Índice Introducción 4 Objetivo 4 Aclaraciones 4 Presentación y acceso al sistema Renspa 5 Adhesión de servicios interactivos 5 Delegación de representación de CUIT 8 Solicitud de inscripción al Renspa (Generalidades) 10 Datos de unidad productiva, titular y establecimiento 12 Datos del titular 12 Datos del establecimiento 12 Datos agrícolas 19 Datos ganaderos 22 Finalización del trámite de solicitud de inscripción 23 Recepción del trámite de solicitud en la oficina local 25 Consulta de inscripciones online 25 Otras operaciones 25 Contacto 28 INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 3 �Introducción El Renspa es el Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios que asocia al productor con la producción y el predio donde realiza la actividad. Los productores ganaderos, agrícolas y forestales deben inscribirse en forma obligatoria y gratuita (Resolución Senasa 423/2014). El presente instructivo muestra paso a paso la adhesión de servicios interactivos en la página de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero (ARCA) con clave fiscal. En el ejemplo se muestra la adhesión al Sistema Renspa, pero todos los servicios se adhieren de la misma manera, solo debe seleccionar el correspondiente del listado de servicios interactivos del organismo. Una vez adherido al servicio se describe la inscripción en el Renspa. Objetivo Esta publicación está destinada a usuarios externos con el fin de orientarlos en la inscripción y actualización de sus datos en el mencionado registro de forma completamente digital. Aclaraciones • El Renspa es un registro de productores (responsable sanitario de la producción). Si usted es propietario y arrienda el campo, quien debe inscribirse es solo el arrendatario, es decir, el responsable de la producción. • Se considera establecimiento a la unidad epidemiológica. En un establecimiento puede haber uno o más productores (Renspa). • Unidad productiva: se considera unidad productiva a la unidad que relaciona al productor con la producción dentro de un establecimiento. • Si usted es productor de cereales, oleaginosas y legumbres debe solicitar el Renspa a través del Sistema Integrado de Información Sanitaria Argentino (SISA). • Si usted es propietario y arrienda el campo para cereales, oleaginosas y legumbres no debe solicitar el Renspa bajo ninguna circunstancia ya que este es el registro de productores. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 4 �Presentación y acceso al sistema Renspa Para acceder al Sistema Renspa del Senasa, el usuario debe ingresar utilizando el navegador Mozilla Firefox. 1. Acceder a la web de la ARCA: www.arca.gob.ar. 2. Ingresar con clave fiscal del titular, indicando CUIT y clave. Adhesión de servicios interactivos 1. Cuando ingrese con su clave fiscal, elija al menú ‘Administrador de relaciones de clave fiscal’ como se indica en la imagen inferior. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 5 �2. Una vez dentro del menú, presionar el botón ‘Adherir servicio’. Seleccionar del listado de organismos disponibles ‘Senasa’ Dentro del menú ‘Servicios Interactivos’ buscar y seleccionar ‘Renspa’ INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 6 �3. Una vez seleccionado el servicio, presionar el botón ‘Confirmar’ para finalizar la adhesión. 4. Para confirmar la adhesión, el sistema muestra un formulario con los datos correspondientes. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 7 �5. Después de que se genere este formulario, cerrar la sesión y volver a ingresar con la clave fiscal para actualizar el menú principal, en donde aparecerán los servicios habilitados. Delegación de representación de CUIT La clave fiscal es una contraseña personal e intransferible. Esta clave habilita al usuario para operar servicios desde la página web de la ARCA de manera segura. Es importante tener en cuenta que, para delegar servicios bajo clave fiscal, se debe previamente tramitar la misma con el nivel de seguridad requerido por el servicio. Para delegar la representación de un servicio interactivo a otro CUIT se deben realizar estos pasos dentro del ‘Administrador de relaciones de clave fiscal’, actuando en representación de la CUIT que adhirió al servicio: INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 8 �1. Seleccionar, en esta pantalla, la opción ‘Nueva Relación’. 2. En la siguiente ventana, presionar el botón ‘Buscar’ para elegir el servicio que se delegará. Aquí el sistema permite elegir el servicio, en este caso ‘Renspa’, del mismo modo que en la adhesión. 3. Luego de elegido el servicio, aparece la siguiente pantalla, ahí presionar el botón ‘Buscar’ para elegir al representante. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 9 �4. A continuación, se visualizará esta pantalla que permite completar la CUIT del representante buscado; presionar ‘Buscar’ nuevamente. 5. Por último, confirmar la delegación en esta pantalla presionando el botón ‘Confirmar’. Solicitud de inscripción en el Renspa (generalidades) El usuario con acceso al sistema podrá consultar los registros (Renspa) que se encuentran bajo su titularidad y realizar las siguientes operaciones: • Consulta de oficina local asignada al Renspa • Origen del Renspa • Operación de actualización (reinscripción) • Impresión de documentos (planilla, tarjeta, rótulo) • Operación de baja (por cese de actividad) • Consulta de preinscripciones (trámites con finalización presencial en la oficina local) • Consulta de inscripciones online (trámites 100% online) • Solicitud de nuevas inscripciones al Renspa INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 10 �1. La solicitud de inscripción al registro se realiza mediante el botón ‘Nueva inscripción’ ubicado al pie de la pantalla (como muestra la figura anterior). El sistema mostrará un mensaje explicando el acceso a la operación. 2. Una vez ingresada a la pantalla, deberán completarse los datos solicitados para el trámite de solicitud. El formulario consta de tres solapas: a. Datos de unidad productiva, titular y establecimiento b. Datos agrícolas c. Datos ganaderos A su vez, cada una de las solapas contiene una serie de secciones en las que se debe indicar la información solicitada: Datos de unidad productiva, titular y establecimiento • Datos del titular • Datos del establecimiento Datos agrícolas • Información general • Malezas resistentes • Cultivos agrícolas Datos ganaderos • Explotaciones A continuación, se brinda la información relevante con respecto a cada uno de los datos que se deberán declarar (esta declaración dependerá de si el establecimiento ya se encuentra o no registrado). INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 11 �Datos de unidad productiva, titular y establecimiento Datos del titular En esta sección debe declararse la información del productor responsable de la producción. Como la inscripción se realiza mediante el portal de la ARCA, los campos para los datos de CUIT/CUIL, razón social, provincia, localidad, dirección, DNI (en el caso de persona física), tipo de persona (humana/jurídica), partido/departamento y código postal ya salen completos. Se deberán completar: • N.° de RENAPA: completar solo si se encuentra inscripto como productor apícola en la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca. • N.° de RENAF: se completa automáticamente si el productor se encuentra inscripto como agricultor familiar en la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca. • Correo electrónico: mediante este medio se llevará a cabo la comunicación en la gestión del trámite por parte de la oficina local que lo atienda. • Teléfono de contacto. Datos del establecimiento En esta sección se deben declarar todos los datos del establecimiento sobre el cual se requiere la solicitud de inscripción. Nuevo establecimiento Si se solicita la inscripción de una unidad productiva sobre un establecimiento que no se encuentra registrado, ante la confirmación del trámite el sistema registrará al mismo (con un número de inscripción) y, sobre él, la unidad productiva a nombre de la CUIT ingresada (con una terminación /00 sobre el número de inscripción del establecimiento). Para solicitar la inscripción de la unidad productiva y del establecimiento, se deberán completar los siguientes datos: • Nombre del establecimiento (obligatorio). • Ubicación: provincia, partido y localidad (obligatorios). • Dirección del establecimiento (obligatorio). • Cuartel, lote, fracción y sección (opcional). • Tipo de explotación realizada: agrícola, ganadera o mixta (obligatorio). • Superficie total del establecimiento (obligatorio). • Condición frente a la tierra del productor (obligatorio). INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 12 �• Oficina local para la atención del trámite (se listarán las oficinas que tienen). • Jurisdicción para la atención del trámite (de acuerdo a la ubicación del establecimiento). Dibujo del polígono Cuando se ingresan provincia y partido (como se muestra en la imagen anterior), el mapa realiza un acercamiento para que se pueda visualizar puntualmente la zona en la que se encuentra el establecimiento. Una vez que se muestra el mapa en el partido al que pertenece el establecimiento, se deberá dibujar el polígono que determina su superficie. El área territorial que abarca el establecimiento debe ser delimitada en el mapa, dibujando en él un polígono –de tantos puntos como se requiera marcar– para lograr la mejor aproximación a la forma real del campo. El trámite requiere de esta información para poder continuar. Importante: el polígono es un dato que identifica al establecimiento y no a la unidad productiva por la cual se está realizando el trámite de inscripción. Para realizar el dibujo del polígono que se solicita, seguir los siguientes pasos: 1. Presionar el botón ‘Edición de polígono’ que habilita el mapa para que se pueda dibujar sobre él, o bien reiniciar la operación de dibujo si se necesita volver a empezar. 2. Luego posicionar el cursor sobre el primer punto que se quiera dibujar y hacer clic con el mouse para dejarlo puesto en el mapa. 3. Repetir estos dos pasos para ir posicionando todos los puntos que conforman el dibujo. 4. Para cerrar el polígono, hacer clic sobre el primer punto que se dibujó. Siguiendo los pasos anteriores, el polígono quedará dibujado en el mapa. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 13 �Los puntos que conforman el polígono (que son coordenadas latitud/longitud) quedarán detallados en el componente ‘polígono’ que se encuentra debajo del mismo. Modificación del polígono Si se necesita cambiar el polígono: • se puede arrastrar un punto específico para moverlo de un lugar a otro; • se puede eliminar un punto específico haciendo shift+clic sobre él; • se puede eliminar el polígono para volver a dibujarlo presionando el botón ‘Edición de polígono’ (el sistema solicitará la confirmación del borrado del polígono a través de una alerta). Una vez que se tenga el polígono en el mapa, presionar el botón ‘centrar marcador’ para ubicarlo dentro de este. El marcador es un punto rojo (una coordenada latitud/longitud) cuya posición generalmente se utiliza para indicar la entrada por la cual se tiene acceso al establecimiento. El sistema controlará que el marcador se encuentre dentro del polígono y no permitirá el registro del trámite de otro modo. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 14 �Al centrar el marcador en el mapa (dentro del polígono dibujado), el sistema completará automáticamente la información de latitud/longitud tanto en formato numérico como G.M.S (grados, minutos y segundos). Si usted posee la información latitud/longitud de su establecimiento o los puntos que conforman el polígono, puede realizar el ingreso de esta información de manera inversa: colocando la información en los componentes, el mapa se actualizará y se dibujará de acuerdo a ellos. Una vez finalizado el dibujo, el trazado del polígono mostrará el área total seleccionada (la cual deberá ser aproximada al área que se declarará dentro de los datos del establecimiento). Además, el sistema mostrará los establecimientos vecinos (como se muestra en la imagen siguiente en color azul), tomando como referencia la ubicación del ‘marcador’. Deben evitarse superposiciones en la georreferenciación de las superficies. Una vez finalizada la carga de datos de la unidad productiva, se debe continuar con la solapa agrícola o ganadera [ver: Datos agrícolas y Datos ganaderos]. Establecimiento existente Si la unidad productiva que se inscribirá pertenece a un establecimiento que ya se encuentra registrado en el Senasa deberá ubicar el establecimiento a través de su número de inscripción o a través de una lista de establecimientos a nombre del titular mediante su CUIT. Si se desconoce el establecimiento o la CUIT del titular del establecimiento para ubicarlo, el componente ‘establecimiento existente’ no deberá ser tildado y tendrá que realizar un trámite para un establecimiento nuevo [ver: Nuevo establecimiento]. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 15 �El procedimiento que se deberá seguir es el siguiente: 1. Tildar la opción ‘Establecimiento existente’ que se encuentra en la parte superior de la sección ‘Datos del establecimiento’; esto desplegará un par de opciones para hallar el establecimiento deseado. El sistema proporciona dos opciones para la ubicación del establecimiento, lo cual permite realizar la búsqueda por número de establecimiento o por CUIT del propietario. Búsqueda de establecimiento existente por número de establecimiento Si el usuario conoce cuál es el establecimiento deberá realizar la búsqueda por número asignado: primero, ubicar el número de inscripción en la casilla de búsqueda y, a continuación, presionar el botón ‘Buscar’ (como muestra la imagen siguiente). 1. Al ingresar el número de establecimiento y presionar el botón ‘Buscar’, el sistema realizará la búsqueda del establecimiento, cargando todos los datos del mismo en la sección ‘Datos del establecimiento’. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 16 �2. Como se puede ver en la imagen superior, se cargan automáticamente los datos del propietario del establecimiento y los datos geográficos del establecimiento. Además, el mapa se actualizará mostrando la localización registrada en el organismo. 3. Si necesita realizar una modificación del polígono mostrado, siga los pasos detallados en: Dibujo del polígono. 4. Para terminar de completar la información solicitada en esta solapa, solo restará completar los siguientes datos: • La condición frente a la tierra del productor. • El tipo de explotación (agrícola, ganadera o mixta). • La oficina local que realizará la atención del trámite (se listan las oficinas locales que poseen jurisdicción para la atención del trámite, de acuerdo a la ubicación del establecimiento). 5. Luego, realizar la carga de las solapas ‘Datos Agrícolas y/o Datos ganaderos’ dependiendo del tipo de explotación que realiza [ver: Datos agrícolas y Datos ganaderos]. Búsqueda de establecimiento existente por CUIT del propietario Si el usuario no conoce cuál es el número de establecimiento pero sí posee la CUIT del titular, deberá realizar la búsqueda mediante esta segunda opción. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 17 �1. Utilizando esta opción de búsqueda, se ingresa la CUIT del propietario del establecimiento y se presiona el botón ‘Buscar’. 2. El sistema responderá completando una lista de establecimientos a nombre de la persona, a partir de la cual debe elegirse aquel necesario para la solicitud. Al seleccionarlo, el sistema completará la información del mismo en la sección. Como se puede ver en la imagen anterior, se cargan automáticamente los datos del propietario del establecimiento y los datos geográficos del establecimiento. Además, el mapa se actualizará mostrando la localización registrada en el organismo. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 18 �Si necesita realizar una modificación del polígono mostrado, siga los pasos detallados en: Dibujo del polígono. 3. Para terminar de completar la información solicitada en esta solapa, solo restará completar la siguiente información: • La condición frente a la tierra del productor. • El tipo de explotación (agrícola, ganadera o mixta). • La oficina local a la que se quiera (se listan las oficinas locales que poseen jurisdicción para la atención del trámite, de acuerdo a la ubicación del establecimiento). 4. Luego, realizar la carga de las solapas ‘Datos Agrícolas y/o Datos ganaderos’ dependiendo del tipo de explotación que realiza [ver: Datos agrícolas y Datos ganaderos]. Datos agrícolas La solapa ‘Datos Agrícolas’ posee tres secciones que deberán ser completadas si la explotación de la unidad productiva es agrícola o mixta: Información general A continuación, se presentan los datos de infraestructura y los procesos que se deberán declarar. • Alambrados: cerco perimetral construido con postes y tendido de alambre galvanizado con el objetivo de marcar su límite y cercar el establecimiento o limitar la presencia de animales. • Cortina forestal: barrera vegetal constituida por arbustos o árboles cuyas hojas pueden caerse en época otoñal (caducas) o quedar persistentes a lo largo del año (perennes), su importancia radica en ser una protección contra el viento y limitar posibles contaminaciones y ocurrencias de plagas. • Galpón de maquinarias: sitio que cumple la función de albergar las herra- INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 19 �mientas y maquinarias destinadas para la producción con el objetivo de garantizar su estado y mantenimiento. • Depósito de agroquímicos y biológicos: sitio o lugar físico aislado, separado de la vivienda, y en el cual se depositan de manera correcta todos aquellos productos químicos y biológicos bajo llave o a resguardo (por ejemplo: fertilizantes, insecticidas, herbicidas, etc., los cuales son utilizados en la producción agrícola). • Detalle proceso de poscosecha: solo para productores de frutas u hortalizas, se deberá declarar el acondicionamiento mínimo (por ejemplo: lavado). • Semilla de uso propio: hace referencia a la utilización de la semilla de la campaña anterior en el nuevo ciclo productivo. Malezas resistentes Solo para productores de cereales y oleaginosas, se deberá indicar si en la unidad productiva (UP) existe alguna de las malezas de la lista resistente a herbicidas. Cultivos agrícolas Aquellos cultivos cuyo producto se comercializa en el mercado interno o externo y su destino es el consumo directo, industrial o propagación de especies vegetales, entre otros. 1. Para declarar un cultivo, ingresar el nombre de la especie (puede escribir el nombre común o científico) y presionar la tecla ‘Tab’ o hacer clic con el mouse sobre el fondo de color celeste en la pantalla; esto ocasionará que el sistema realice una búsqueda de productos relacionados, actualizando el combo que se encuentra del lado derecho de la pantalla. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 20 �2. Una vez ubicado el producto que se desea declarar, seleccionarlo y completar el resto de la información pertinente: • Superficie cultivada: Se debe indicar la superficie cultivada para cada especie, expresada en hectáreas (Ha); esta indicación se puede realizar bajo dos modalidades: • Superficie cubierta, significa que se produce utilizando invernaderos o algún otro tipo de cobertura como ser bajo dosel. • Superficie descubierta, el cultivo se realiza a campo abierto sin ningún tipo de cobertura. • Cultivo orgánico: Producto vegetal comercial obtenido bajo condiciones de producción sin el empleo/uso de agroquímicos, entre otras características, para lo cual deberá acreditarse tal situación con la presentación del Certificado de Producción Orgánica, emitido por certificadoras reconocidas ante el Senasa. • Tipos de riego en secano: Se trata de una producción agrícola sin riego (por ejemplo, algunos cultivos extensivos). • Por aspersión: aplicado mediante aspersores. • Por goteo: aplicado mediante el uso de mangueras, caños y el empleo de picos dosificadores dirigidos. • Por manto: aplicado en la modalidad de inundación transitoria. • Por surco: aplicado por manejo de camellones y surcos. • Tipos de destino (no obligatorio): se podrá elegir más de una opción y se podrán seleccionar distintos destinos de la producción: • Consumo animal: para consumo animal de animales. • Exportación: para el mercado externo. • Industria: para industrialización de la producción primaria. • Mercado interno: para la comercialización dentro del país. • Propagación: en caso que el productor realice material de propagación y multiplicación, no semillas. • Uso propio: cuando el productor haga uso, en su establecimiento, de la producción. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 21 �3. Al finalizar, agregar el cultivo con el botón: ‘Agregar cultivo agrícola’. 4. Repetir este procedimiento por cada uno de los cultivos que desee declarar. Leer las resoluciones que se muestren en pantalla y dar conformidad (de corresponder). Datos ganaderos La solapa para la declaración de datos ganaderos consta de dos secciones, que deberán ser completadas si la explotación de la unidad productiva es ganadera o mixta. Explotaciones Para completar esta sección, se deben ingresar las explotaciones ganaderas que se realizarán según especie animal. Allí seleccionar la explotación correspondiente y luego presionar la + verde para agregarla al recuadro ‘Explotaciones seleccionadas’ (como se muestra en la siguiente imagen). INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 22 �Finalización del trámite de solicitud de inscripción 1. Una vez ingresados todos los datos y tildadas todas las declaraciones juradas de las solapas correspondientes, apretar el botón ‘Aceptar’ (ubicado al pie del formulario). De ser necesario, el sistema enviará un correo electrónico para validar la cuenta declarada en la sección ‘Datos de UP, titular y establecimiento’, ya que esta será la vía por la cual se efectuará la comunicación entre el solicitante y la oficina local seleccionada, una vez que se complete el registro. El sistema informará sobre esta inscripción mostrando en pantalla lo siguiente: Se deberá tener al alcance el número de trámite, correo electrónico y CUIT registrados ante cualquier eventualidad. Estos datos servirán para la identificación unívoca del trámite realizado. 2. Para terminar con el proceso de registro del trámite, acceder a la cuenta de correo electrónico declarado y seleccionar aquel mensaje con la siguiente información: • Remitente: “Sistema Renspa” <sistema_renspa@senasa.gob.ar> • Asunto: “Inscripción online al Renspa” En ese correo electrónico se encontrará información resumida de la solicitud junto con un enlace al pie que deberá ser utilizado para finalizar el proceso de inscripción. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 23 �Revisar la casilla de spam si no encuentra el correo electrónico enviado en su bandeja de entrada. Una vez completado el proceso de solicitud de inscripción, puede realizar el seguimiento de su trámite desde la pantalla accesible a través del enlace: ‘Consulta de inscripciones online’, disponible en la pantalla principal. Desde esta pantalla, puede conocer el estado actual de la petición. Recepción del trámite de solicitud en la oficina local La oficina local del Senasa asignada al trámite evaluará los datos declarados para confirmar o rechazar la solicitud. Durante la atención del trámite, si el agente así lo requiere puede comunicarse por correo electrónico para solicitar información requerida en la atención de la solicitud. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 24 �La resolución del trámite (ya sea una confirmación o un rechazo) será remitida al correo electrónico confirmado y se comunicará a la oficina local asignada ante cualquier eventualidad. La credencial de inscripción puede ser impresa desde la pantalla principal una vez recibida la notificación de confirmación al registro [ver: Impresión de documentos]. Consulta de inscripciones online El usuario podrá consultar el listado de inscripciones online realizadas y su estado. Este tipo de modalidad es 100% online, sin necesidad de finalización presencial en la oficina local. Accediendo a esta pantalla, podrá realizar un seguimiento de sus inscripciones online. Otras operaciones Oficina local del Renspa 1. Para conocer la oficina local asociada al Renspa, posicione el cursor del mouse sobre el ícono: 2. Si necesita ponerse en contacto con la oficina local por su trámite, puede ubicarla a través de la información publicada en el siguiente enlace. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 25 �Actualización de datos (reinscripción) Todos los productores agrícolas deben realizar una actualización de datos al menos una vez al año o cuando cambie de cultivo o actividad. 1. La actualización se realiza ingresando a través de la página de la ARCA, realizando el login con CUIT y clave fiscal y adhiriendo al servicio de Renspa. 2. Una vez en el sistema, ubicar el registro de interés de la lista de aquellos que se visualizan y presionar el botón ‘Reinscribir’. 3. Mediante esta opción, el sistema redirigirá al formulario de actualización. Se deberá realizar la actualización de datos anual si se trata de un productor agrícola y forestal, mixto o productor ganadero en zonas de no vacunación antiaftosa. La credencial actualizada puede ser impresa desde la pantalla principal una vez realizada la reinscripción en el registro [ver: Impresión de documentos]. Es obligatorio que todos los productores mixtos y ganaderos de las zonas de no vacunación antiaftosa actualicen sus datos anualmente. Impresión de documentos Desde la pantalla principal, pueden imprimirse los siguientes documentos: • Planilla de inscripción • Credencial • Rótulo INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 26 �Baja (por cese de actividades) La baja (únicamente por cese de actividades) podrá realizarse accediendo desde la pantalla principal, presionando el botón ‘Baja’ sobre el registro deseado. De este modo, se accederá a una pantalla para realizar la baja de la unidad productiva. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 27 �Reactivación de un registro dado de baja Si el usuario posee un registro (Renspa) dado de baja por cese de actividades y necesita que vuelva a estar activo, simplemente deberá llevar a cabo una operación de reinscripción sobre el Renspa [ver: Actualización de datos (reinscripción)]. Si el registro está dado de baja por un motivo diferente a ‘cese de actividades’, el usuario deberá comunicarse con la oficina local asociada al mismo [ver: Oficina local del Renspa]. Contacto Ante dudas o consultas, no dude en utilizar el bot disponible al pie en la pantalla principal del sistema (a la derecha) para comunicarse con la mesa de ayuda. INSTRUCTIVO. RENSPA: INSCRIPCIÓN Y ACTUALIZACIÓN DE DATOS 28 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Renspa: Inscripción y actualización de datos. 100 % online. Instructivo Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Relation A related resource Resolución SENASA N° 423/2014 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0176 Abstract A summary of the resource. Esta publicación está destinada a usuarios externos con el fin de orientarlos en la inscripción y actualización de sus datos en el Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (Renspa), de forma completamente digital. Se detalla el paso a paso para realizar la adhesión de servicios interactivos en la página de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero (ARCA) con clave fiscal. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivo Aclaraciones Presentación y acceso al sistema Renspa Adhesión de servicios interactivos Delegación de representación de CUIT Solicitud de inscripción al Renspa (Generalidades) Datos de unidad productiva, titular y establecimiento Datos del titular Datos del establecimiento Datos agrícolas Datos ganaderos Finalización del trámite de solicitud de inscripción Recepción del trámite de solicitud en la oficina local Consulta de inscripciones online Otras operaciones Contacto https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/c67e321db4a4af3ffda74dc58bd5e2ed.pdf 05a674584415fb64387c5c4b00dcf3ac PDF Text Text Guía para el manejo responsable de residuos por el uso de productos garrapaticidas Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2024 �Introducción Esta guía tiene como objetivo establecer los procedimientos generales que se deben seguir para el manejo responsable de residuos provenientes de productos veterinarios garrapaticidas (PVG). Es importante tener en cuenta que todas las indicaciones para el uso y posterior descarte se encuentran detalladas en el prospecto, según el producto utilizado. Por lo general, se debe evitar o minimizar la generación de residuos por el uso de PVG. La eliminación de los productos, soluciones, emulsiones y cualquier subproducto debe cumplir en todo momento con los requisitos de la legislación de protección ambiental y disposición de residuos, en acuerdo con las normativas locales, nacionales e internacionales. I. Procedimiento para el desecho de envases de PVG a. Eliminar los productos sobrantes no reciclables –como frascos, bidones y bolsas– a través de un contratista de eliminación de residuos fehacientemente autorizado en la región. b. Los envases de desecho deben reciclarse toda vez que sea posible y solo puede considerarse el enterramiento o la incineración cuando el reciclaje no sea viable. Esta práctica se podrá realizar en un lugar seleccionado para tal fin. c. Previo a la eliminación de envases de PVG de uso en forma de inmersión/ aspersión, se debe realizar el lavado aplicando la técnica internacional del triple lavado, la cual consiste en llenar una cuarta parte del envase vacío con agua, tapar y agitar en forma enérgica por un minuto, vaciando el contenido en el bañadero, repitiendo esta acción en dos ocasiones más. d. Evitar que los residuos de limpieza o enjuague lleguen a un curso de agua o cualquier forma de desagüe. e. Cuidar la manipulación de recipientes vacíos que no hayan sido limpiados o enjuagados, ya que podrían estar presuntamente vacíos. f. Seguir las recomendaciones de uso que indica el producto y tener precauciones con respecto al almacenamiento, cuidados durante la aplicación, derrames accidentales, entre otros. g. Prestar especial atención a las indicaciones del laboratorio –en cajas, prospectos y marbetes– con respecto a las precauciones generales y recomendaciones en caso de incendios, derrames, contraindicaciones y limitaciones de uso, observando los PICTOGRAMAS de seguridad aclaratorios. GUÍA PARA EL MANEJO RESPONSABLE DE RESIDUOS POR EL USO DE PRODUCTOS GARRAPATICIDAS 3 �Manejo adecuado y cuidado del medio ambiente Nuevos pictogramas Técnica del triple lavado Hágalo 3 veces Agrege agua hasta 1/4 de la capacidad del envase Cierre el envase y agite durante 30 segundos Vierta el agua del envase en el equipo pulverizador Perfore el envase para evitar su reutilización II. Procedimiento de inactivación de residuos químicos en bañaderos de inmersión y de aspersión a. Los residuos químicos de los bañaderos, tanto de inmersión como de aspersión, no deben eliminarse en ningún tipo de desagüe, curso o corriente de agua, ni en cercanías de las mismas sin ser tratados. b. En los PVG con base en las amidinas (amitraz) se debe acidificar el medio inactivando el mismo a través del agregado de ácido muriático comercial en proporción de 500 ml por cada 1.000 litros de líquido en el baño de inmersión o pileta de recupero del baño de aspersión y agitar en forma vigorosa. c. En los PVG con base en piretrinas sintéticas o piretroides y las mezclas piretrinas-organofosforados se debe alcalinizar el medio inactivando el mismo con el agregado de una solución de hipoclorito de sodio en proporción de 10 litros por cada 1.000 litros de líquido o 10 kilos de hidróxido de calcio por cada 1.000 litros de agua, en el baño de inmersión o pileta de recupero del baño de aspersión y agitar en forma vigorosa. GUÍA PARA EL MANEJO RESPONSABLE DE RESIDUOS POR EL USO DE PRODUCTOS GARRAPATICIDAS 4 �d. Los métodos descriptos se encuentran recomendados por el laboratorio elaborador y aprobado por el organismo regulador correspondiente. Además, se lo puede encontrar en el marbete del producto. III. Verificación de la inactivación Para constatar la inactivación de la emulsión, se deberá realizar el análisis de la concentración del principio activo correspondiente del líquido de balneación o aspersión. Para lo descripto en el inciso b. del apartado II) puede estimarse un tiempo de inactivación entre dos (2) y cinco (5) días; para lo descripto en el inciso c. del apartado II) el tiempo estimado es de diez (10) a quince (15) días. Contacto Programa de Garrapata del Bovino Correo electrónico: garrapatas@senasa.gob.ar Teléfono: (11) 3144-1973 GUÍA PARA EL MANEJO RESPONSABLE DE RESIDUOS POR EL USO DE PRODUCTOS GARRAPATICIDAS 5 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Guía para el manejo responsable de residuos por el uso de productos garrapaticidas Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0175 Abstract A summary of the resource. Esta guía tiene como objetivo establecer los procedimientos generales que se deben seguir para el manejo responsable de residuos provenientes de productos veterinarios garrapaticidas (PVG). Por lo general, se debe evitar o minimizar la generación de residuos por el uso de PVG. La eliminación de los productos, soluciones, emulsiones y cualquier subproducto debe cumplir en todo momento con los requisitos de la legisla�ción de protección ambiental y disposición de residuos, en acuerdo con las normativas locales, nacionales e internacionales. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción I.Procedimiento para el desecho de envases de PVG II. Procedimiento de inactivación de residuos químicos en bañaderos de inmersión y de aspersión III. Verificación de la inactivación Contacto Garrapatas https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/56541f1b5f1e36dc29eef0c7679b1b5f.pdf fac203e52e86bb4237914f4bb4703e42 PDF Text Text MANUAL DE PROCEDIMIENTO Uso correcto de bañaderos y productos veterinarios garrapaticidas Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 4 Objetivo 4 Bañaderos: de inmersión y de aspersión 4 Emplazamiento común 4 Estructura básica común a ambos bañaderos 5 Infraestructura de bañaderos de inmersión 5 Especificaciones 5 Cubicación 7 Elementos 8 Manejo 9 Infraestructura de bañaderos de aspersión Principales características 13 13 Especificaciones 14 Limpieza de tropas para despacho y protocolos 16 Protocolo con baño de inmersión 16 Protocolo con productos pour on o inyectables 17 Uso de productos veterinarios garrapaticidas distintos de balneación 18 Uso racional de los PVG 18 Planificación de los tratamientos 19 Contacto 21 �Introducción La garrapata común del bovino es un parásito que posee un ciclo biológico caracterizado por una etapa ambiental y otra parasitaria (sobre el animal). Esta parasitosis se encuentra complejizada porque, en su etapa ambiental, los tiempos de sobrevida son muy variables, sumado a que la garrapata posee una resistencia innata a las moléculas (incluso a las que todavía no ha sido expuesta), con una gran capacidad reproductiva de las teleoginas (hembra adulta) y la posibilidad de ser potenciales vectores de enfermedades asociadas, como la tristeza bovina. Objetivo El presente manual está destinado a productores, veterinarios y profesionales del ámbito rural. Esta publicación tiene como propósito informar sobre tratamientos garrapaticidas prolijos y eficientes, para lograr que el producto aplicado exprese su máximo potencial de efecto ixodicida sobre la población de garrapatas presente en el animal, minimizando así los tiempos de aparición de la resistencia a las diferentes moléculas. Bañaderos: de inmersión y de aspersión Emplazamiento común Las instalaciones del bañadero deben contemplar las interacciones con el ambiente y estar ubicadas –preferentemente– en un sitio que sea central (respecto a los potreros del establecimiento), sobre un terreno elevado, para asegurar el drenaje y facilitar el desagote del baño (evitando la contaminación de cursos naturales de agua). Además, se debe contar con una buena disponibilidad de agua y acceso permanente a los caminos firmes del establecimiento. Estructura básica común a ambos bañaderos a. Corrales de encierre: deben tener una capacidad variable, de acuerdo al tamaño del rodeo involucrado. b. Manga de entrada al baño: es recomendable que cuente con un piso rugoso para favorecer la limpieza de las pezuñas, previo al ingreso del bañadero; preferentemente, construir un lavapatas. c. Escurridero: es una plataforma de drenaje donde se depositan los animales posteriormente al nado con el objetivo de que estos escurran todo el excedente líquido. Mide aproximadamente 4 x 5 metros y está conectado directamente a la salida del baño. Específicamente se recomienda: • Un escurridero dividido en dos partes, con una puerta que controle alternativamente el ingreso hacia las dos secciones (derecha e izquierda). USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 4 � • Un piso de concreto con peldaños en sus orillas y un desnivel adecuado para drenar el excedente hacia la pileta de decantación. • Que el bañadero se encuentre techado. De lo contrario, se debe prever una salida del agua de lluvia hacia el exterior. Cuando no se utilice el baño, esta salida debe permanecer abierta. Infraestructura de bañaderos de inmersión Especificaciones En la pileta, la pared frontal no debe tener un ángulo recto con el piso, por lo tanto, se sugiere una concavidad amplia, a fin de evitar que se deposite mucho sedimento. Por su parte, las paredes laterales –tanto en el ingreso como en el egreso del bañadero (sección de la rampa de despegue y hasta el final de la rampa de salida)– deberán ser rectas y tener 0,30 m de espesor y 1,75 m de alto desde el nivel del suelo. En la entrada del bañadero, las paredes laterales deben continuar por al menos 2 metros; en su salida, se recomienda que continúen por al menos 3 metros más, para que los animales no puedan ver hacia afuera. En la parte media, deben tener, al menos, entre 40 y 50 cm sobre el nivel del líquido; estas paredes pueden contar con un reborde cóncavo superior interno (a 40 USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 5 �cm del nivel de trabajo del líquido) para desviar y hacer rebotar hacia la pileta del bañadero el líquido que se levanta por las paredes. El largo deberá permitir un tiempo de nado correcto del animal; es decir, midiendo la pileta y estando al nivel de la superficie del líquido, no debería ser menor a 11/12 metros, llegando a unos 13/14 metros totales hasta el final de la escalera de salida. A nivel de la parte inferior, no menor a 7 metros. Preferentemente, el piso debe tener un declive leve (1 cm por cada metro de longitud total) hacia la escalera de salida, a los fines de facilitar el vaciado del líquido en momentos de limpieza y recambio del producto. Respecto a la profundidad del baño, la misma debe tener un nivel no menor a 2 metros, de forma tal que asegure la completa inmersión del animal. En cuanto al ancho del baño, en el nivel del agua debe ser entre 0,85 y 1,05 m; mientras que hacia el fondo debe disminuir a 0,45 - 0,60 m. La rampa de despegue es una plataforma desde la cual saltan los animales al baño. La misma debe contar con un largo de 1,2 a 1,5 m. y 0,85 m. de ancho, con desnivel hacia el baño y una superficie sutilmente áspera, para proporcionar el apoyo adecuado del bovino. El borde de la rampa estará convenientemente proyectado en forma de un labio redondeado hacia el tanque, con el objetivo de hacer rebotar las olas hacia adentro de la pileta principal. Para un apoyo más seguro, la salida de la rampa debe contar con gradas bajas, de 0,15 m de alto y 0,40 m de profundidad. La estructura del bañadero también debe precisar de dos piletas de decantación que, por su diseño y disposición, detienen las partículas más gruesas del retorno del líquido de baño. Es necesario corroborar la altura de los caños de ingreso y egreso de los líquidos, tapones, etc. Las dos piletas decantadoras (con medidas de 40 cm x 40 cm x 80 cm), que se ubican entre el escurridero y el bañadero conectando ambas secciones, permiten el retorno del líquido de los animales tratados con la menor cantidad posible de material orgánico. El techo –o algún tipo de cobertura– es obligatorio para el bañadero. Debe abarcar incluso el escurridero y la rampa de despegue para disminuir la evaporación y evitar el ingreso de agua de lluvia a la pileta principal. Cabe USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 6 �destacar que la altura del techo es clave para la actividad del baño, ya que el largo de los mangos de las horquillas y agitadores puede verse dificultado si se encuentra a menos de 4 m. Usualmente, el techo se construye con chapa galvanizada y a dos aguas. La pileta de cubicación debe tener al menos una capacidad de 1000 (un mil) litros, con medidas de 1m x 1m x 1m. La misma tiene que estar conectada con el baño cerca de su entrada, a través de un caño grueso de aproximadamente 4 pulgadas y con una llave de corte de paso de agua; en la pared de la pileta de cubicación deberán indicarse los volúmenes correspondientes a 500 y 1000 litros. Para realizar un óptimo mantenimiento edilicio, las estructuras de todo el bañadero deben mantenerse en buenas condiciones –arreglando y evitando fisuras en la construcción– sobre todo por debajo de la línea de agua del nivel de trabajo, que permitan el drenaje continuo del principio activo. Cubicación La cubicación de un bañadero es fundamental para determinar el volumen de agua necesario para el tratamiento y es un requisito para su habilitación. El baño estará oficialmente habilitado cuando la cubicación sea realizada por personal del Senasa o por los entes sanitarios que se encuentren capacitados. Sin una correcta cubicación del bañadero no podrá hacerse una eficaz aplicación del tratamiento. Una diferencia de 20 litros puede ocasionar cambios en la concentración del producto. La cubicación debe realizarse con una probeta, elemento de laboratorio calibrado de 1 o 5 litros. Con este instrumento se calibrará un volumen máximo de 20 litros en un balde de plástico, que luego permitirá cargar la pileta de cubicar y finalmente la pileta principal del baño. El balde deberá estar perforado y tener ranuras al llegar a los 20 litros de carga. Esto permitirá que el líquido que se requiera medir en el balde, nunca supere el volumen calibrado. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 7 �La primera línea de cubicación de la regla debe marcarse –usualmente– a partir de los 5000 litros. Luego, las marcas se aplicarán cada 1000 litros hasta llegar a 8000 o 9000. A partir de este volumen, las marcas se realizarán cada 500 litros, hasta llegar al nivel de uso del baño, con la profundidad adecuada. Luego, siguiendo el mismo procedimiento, marcarán en la regla 2000 litros más de agua, que luego serán desechados. Esto se realiza para poder conocer y prever el volumen de agua ingresado por lluvias. Al confeccionar la regla, se debe tener la precaución de tomar las medidas (con una cinta métrica) de cada una de las marcas de la cubicación y registrarlas en una planilla, preferentemente un registro en papel. También se recomienda confeccionar una regla más de repuesto, para que en el caso de rotura o pérdida, esta pueda ser reemplazada. Elementos La regla es un elemento clave y muy importante del bañadero, ya que de su correcta calibración y uso depende –entre otras cosas– el buen funcionamiento del bañadero. Con la regla se lleva a cabo una correcta reposición y refuerzo del principio activo y, por lo tanto, el mantenimiento adecuado de su concentración. Para su construcción se puede utilizar madera, pero debe recordarse poner una chapa en la base (pie) para evitar el desgaste u opcionalmente una regla con forma de T, que llegue hasta unos 20 cm del piso del bañadero. Debe estar correctamente marcada, conforme la cubicación practicada en la pileta principal. Al confeccionar la regla, se debe tener precaución al momento de tomar las medidas de cada una de las marcas de la cubicación y USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 8 �registrarlas en una planilla. Esto permitirá, en caso de rotura o pérdida, que la misma pueda ser reemplazada. El agitador o removedor es la herramienta clave para mezclar y homogeneizar la preparación del líquido garrapaticida; debe tener un mango lo suficientemente largo –aproximadamente 2,50 m–, para garantizar que el operario llegue a los extremos inferiores de la pileta donde se produce la mayor concentración de sedimentos que secuestran partículas del producto. Las horquillas son otro elemento necesario y fundamental al momento de usar el bañadero, ya que permitirá sumergir al menos 2 veces la cabeza del animal durante el baño. Manejo La preparación de la formulación inicial se debe realizar según las indicaciones, cumpliendo con los volúmenes de agua calibrados. Un baño que no esté cubicado tendrá problemas en el manejo de los volúmenes de agua y consecuentemente en la concentración del principio activo. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 9 �a. Pie de baño: es la carga inicial de un producto veterinario garrapaticida (PVG), es decir, la cantidad de producto incorporado en el agua al preparar un baño. Generalmente, se expresa como litros de producto por cada 1000 litros de agua. b. Reposición y refuerzo del principio activo. Se deberá realizar cada 1000 litros como máximo. Cuando el nivel de nado o trabajo sea inferior a este volumen, deberá hacerse la reposición de agua y refuerzo del PVG. Se recomienda siempre seguir las indicaciones del laboratorio. c. Es fundamental entender la importancia de la medición del pH del líquido garrapaticida. Para ello, se utilizan tiras reactivas comerciales o un peachímetro digital. Los productos a base de amitraz trabajan en medio alcalino (pH 12-14), razón por la cual su estabilizante es la cal (hidróxido de calcio). Si el pH alcanza o baja de 10, el amitraz se desnaturalizará rápidamente. Los piretroides, fosforados o combinaciones funcionan a pH neutro o ligeramente ácido (6.4-6.8, 7) y no requieren condiciones de manejo de pH, ya que naturalmente las soluciones tienden a acidificarse debido a su contaminación con materia orgánica (pelos, materia fecal y tierra). d. El análisis de concentración del principio activo se debe realizar previo a la utilización de un nuevo baño, cuando hayan pasado una cantidad considerable de animales que haga suponer problemas en la concentración del líquido garrapaticida, o luego de un tiempo de inactividad del bañadero. Esto último se debe a que los tiempos de inactividad del bañadero determinan la acción de descomposición de los principios activos, tanto por acción microbiana como por el cambio del pH de la preparación. Por ello, es clave realizar este análisis antes de reiniciar su uso. Lo correcto es realizar cada 90 a 180 días, establecido según criterio técnico. El líquido garrapaticida del bañadero se encuentra expuesto a factores ambientales externos, que modifican o perjudican la estabilidad de los principios activos y su acción ixodicida. DESGASTE DEL BAÑADERO Suciedad Acidez Arrastre Factores principales en la concentración del p.a. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 10 �Esta muestra del líquido del baño debe ser tomada por personal capacitado inmediatamente finalizada la balneación de los animales. La extracción de la misma se realiza mediante la introducción de una botella descartable, que puede estar atada a la regla del baño; esta última se sumerge en la parte media del bañadero –a una altura equidistante entre el piso y la superficie– y se llena ¾ del envase con el líquido. Para finalizar el proceso de remisión de la muestra, se debe adjuntar el protocolo completo y enviarla a un laboratorio habilitado e inscripto en la Red Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab). El líquido será analizado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), a los fines de obtener el dato preciso de la concentración del principio activo del bañadero al momento de la toma de muestra. Además, nos brinda información del pH y el porcentaje de sedimentos presentes, lo que permite luego realizar las correcciones adecuadas, según indicación del laboratorio o del profesional interviniente. e. Factores para tener en cuenta en el momento de la balneación • Balneaciones: previo a realizar los baños, agitar correctamente con el removedor y durante 10 minutos el líquido garrapaticida para obtener una correcta homogeneización del producto en todo el bañadero. Luego, se deberá realizar el pasaje de los animales antes de iniciar la rutina de su baño en los corrales. • Mojar todo el cuerpo del animal durante 15 segundos y sumergir al menos 2 veces la cabeza de cada animal, utilizando las horquillas. • Llevar un ritmo de baño constante, sin apuros y logrando que ningún animal quede sin ser tratado. • Recuperación del líquido de baño del escurridero. Una vez escurridos los animales (en un periodo acorde), verificar que se produzca una buena recuperación del líquido, con un declive correcto para el retorno del mismo. Se debe tener en cuenta no dejar un tiempo excesivo, ya que los animales defecan y orinan, lo cual afecta la calidad y composición del líquido recuperado. • Reposición y refuerzo. Luego del pasaje de determinada cantidad de animales y una vez que se han consumido 1000 litros del líquido de baño (o el 10% del volumen de trabajo), el bañadero debe volver a sus niveles iniciales mediante el agregado de agua y la cantidad necesaria del producto para recuperar la concentración del principio activo. • No mezclar distintos PVG aunque la molécula sea la misma ya que, de acuerdo a la marca comercial, la formulación será diferente (excepto extensión de marca). • En los bañaderos cargados con PVG elaborados con amitraz no se deben agregar otras sustancias diferentes del estabilizante específico. El producto requiere de un medio alcalino (pH 12 – 14). • En los bañaderos cargados con PVG elaborados con piretroides y/o mezclas piretroides y fosforados no se deben agregar sus- USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 11 �tancias acidificantes sin haber consultado previamente al laboratorio elaborador. El producto requiere de un medio ácido a neutro (pH 6.4-6.8 a 7). f. Planillas de registro: durante el uso del bañadero es fundamental llevar actualizadas las planillas de cubicación y de pasaje para registrar, de forma ordenada, el nivel del bañadero al inicio y finalización cada jornada de baño. Se deberá registrar la fecha, reposiciones y refuerzos, cantidades, litros de agua agregados, número de animales bañados y todo dato que favorezca a un efectivo control de manejo. Errores frecuentes cometidos en los baños • Instalaciones deficientes y personal insuficiente. • Baños parciales del lote (un solo animal sin bañar ya es un baño parcial). • Falta de control y supervisión del encargado (bañar animales sedientos o cansados). • Mala cubicación del baño. • Preparación incorrecta del pie de baño. • Tiempo de nado corto, sin respetar los tiempos mínimos (15 segundos por animal). • Incorrecta sumersión de la cabeza. • Poca profundidad del baño. • El uso del baño hasta descenso del nivel óptimo (más del 10%) complica la reposición. • Incorrectas reposiciones y refuerzos del producto activo. • Uso del baño vencido, por tiempo o número de animales bañados. • No identificar los animales bañados, mezclando tratados con no tratados. • Intervalo incorrecto entre baños. • Mezclar principios activos o productos comerciales (aunque sean de la misma familia química). • Bañar en días de lluvia o pronóstico de la misma. • Bañar a “manga abierta”, con apertura de las puertas de salida del escurridero. • Trabajar con corrales muy embarrados. • No dejar escurrir bien los animales luego del baño. • Arrear los animales recién bañados a un potrero con agua o que USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 12 �tengan agua en el trayecto. • No realizar los análisis periódicos del contenido recomendado. • No asegurar el cierre del retorno de agua del escurridero. • No llevar los registros del baño (pasaje, refuerzo, reposiciones). • No registrar el nivel al inicio, durante y después de cada baño (si se agrega agua o producto). • No agitar bien el contenido antes del inicio del baño. Infraestructura de bañaderos de aspersión Principales características El bañadero de aspersión o “manga de aspersión” para uso en rodeos o lotes chicos funciona como un túnel cerrado, en donde el techo, los laterales y –en algunos casos– el piso o los laterales inferiores operan como soporte para la instalación de las mangueras que cubrirán dichas superficies del túnel. En este último, se dispersará el líquido a presión, a través de picos de aspersión o perforaciones bien logradas, de modo tal que cuando se produce el pasaje de los animales por la manga, estos resulten mojados completamente. Factores para tener en cuenta en el uso del bañadero de aspersión • Método de aplicación amigable en cuanto al bienestar animal. Su manejo es más práctico, ya que no requiere de mucho personal. • Cuando la aplicación del producto exija dilución previa, se deben respetar los volúmenes recomendados y las indicaciones del laboratorio. • La pulverización de los animales no deberá ser realizada durante las horas más calurosas del día y deberá realizarse preferentemente a favor del viento (nunca en contra por peligro de intoxicación) y, en lo posible, a contra pelo. • Evitar pulverizar animales cansados, sedientos o debilitados. • El final del túnel debe terminar sin luz (escurridero techado) o con luz tenue. • Se estima que un bovino adulto necesita un mínimo de cinco (5) litros de preparación para mojar el animal entero. El volumen exacto dependerá del tamaño y la raza del animal en cuestión (se calcula aproximadamente en el 1% del peso vivo). • No requiere mayor preparación previa, –como medir o completar nivel, refuerzo y reposición, pH–. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 13 � • Mejor aprovechamiento del agua, ya que solo se prepara un volumen de líquido específico para la cantidad de animales que se bañarán. • Menor contaminación ambiental. • No requiere monitoreo. • Se utiliza producto en concentración de pie de baño. Así, mantiene su estabilidad asegurando la eficacia. • No hay posibilidad de degradación o metabolización (bacterias, hongos) que altere su estructura y su eficacia. • Prolonga la vida útil de los productos. • Permite la fácil rotación de los principios activos, ya que en cada ronda de baño se puede utilizar un producto garrapaticida distinto. • Se recomienda trabajar sin recupero para su reutilización. Solamente se realiza el recupero para proceder a la inactivación del garrapaticida, previo a su descarte. • La velocidad de pasaje de los animales debe ser regulada mediante el uso de un sistema de peine y banderas a la salida o cortina de nylon. • En caso de que los animales no resulten totalmente mojados, se puede repetir la ronda de pasaje. Especificaciones El bañadero debe tener una estructura similar a una manga (de madera o aluminio), con la condición de que sea diseñado como un túnel cerrado, considerando las siguientes especificaciones: a. Medidas de la manga (largo/ancho/alto): 6/1.22/2 metros. b. Piso: preferentemente de hormigón, aunque existen también de madera y acero inoxidable. c. Paredes: conservarán las mismas medidas que la manga, continuando en un túnel cerrado y cubiertas de chapa galvanizada u otro material impermeable. d. Presión de la bomba: mínimo 2 pulgadas y 10 HP. e. Picos de aspersión: muchas veces dependerán del largo de la manga, variando en la cantidad; pero deben ser distribuidos de manera uniforme, tanto en los laterales como arriba y abajo, de manera tal de que sean suficientes como para verificar el total mojado del animal. f. Dirección de los picos: no debe estar enfrentada sino en dirección oblicua/diagonal, mirando hacia adentro de la manga. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 14 �g. Escurridero: mismos requisitos descriptos para el bañadero de inmersión. h. Pileta o cisterna de preparación del líquido garrapaticida: mínimo mil (1000) litros. i. Cisterna de recupero: deberá ser del mismo volumen que la cisterna de preparación. Prestar especial atención a las indicaciones de uso del laboratorio, ya que las concentraciones para la preparación del producto podrían variar con respecto al uso por inmersión. Se recomienda no desarrollar o utilizar estructuras muy caseras, ya que se incurriría en el mismo efecto que al usar una mochila de aspersión. Una de las principales debilidades del método de aplicación por aspersión radica en su capacidad limitada para mojar completamente al animal o en la insuficiente impregnación de áreas específicas del cuerpo, como puede ser la región inguinal, las ubres y el interior de las orejas. Esta debilidad se minimiza con: • un mayor largo de la manga de aspersión, ya que existe una correlación entre el largo y la cantidad de picos; • sistema de tuberías y boquillas suficientes (arriba, laterales, abajo); • buena presión constante de agua, a través de una bomba; • debe contar con tanque para la preparación de la formulación, suministro de energía o motor generador para la bomba; • que sea una manga cubierta (túnel); • asegurar el correcto mojado (para ello se pueden realizar dos pasadas de los animales por la manga). USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 15 �Una buena aspersión debe generar una nube que dificulte la visión de un lado al otro de la manga. Limpieza de tropas para despacho y protocolos Antes de realizar los tratamientos, es fundamental tener en cuenta que: • Todos los animales deben estar identificados con caravanas oficiales, registradas ante el Senasa. • Antes de elegir PVG aprobados por el Senasa, es necesario asesorarse con un veterinario privado. • Los tratamientos funcionarán siempre y cuando la población de garrapatas que estemos tratando sea susceptible al principio activo. • Verificar la disponibilidad de un bañadero con análisis actualizado en el establecimiento. Protocolo con baño de inmersión La limpieza de tropas con baños de inmersión debe realizarse de la siguiente manera: • Aplicar dos (2) baños, con un intervalo de nueve (9) días. • Revisar al animal cinco (5) días después del último baño. • Si el animal resulta limpio se podrá despachar. • Previo al carguío de la tropa, realizar el tratamiento precaucional. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 16 �Protocolo con productos pour on o inyectables La aplicación de PVG autorizados por el Senasa, distintos a los de inmersión, son una opción válida cuando no se cuenta con un bañadero de inmersión o aspersión o cuando detectamos resistencia de la garrapata a las drogas de contacto (amitraz, cipermetrina, etc.) Para pour on, utilizar formulaciones que contengan fluralaner, fipronil o piretroides como principio activo. Existen también otros productos combinados con fipronil + avermectinas (ivermectina o abamectina). Para la aplicación de inyectables existen productos monodroga, es decir, formulaciones que contienen un solo principio activo. Por ejemplo, dentro de la familia de las avermectinas se encuentran varios productos que contienen ivermectinas en diferentes concentraciones, algunos otros con doramectina. En general, los PVG de tipo inyectable no son los más aptos para lograr una correcta limpieza de los animales. Si elegimos estos productos, se recomienda –previo a su aplicación– asesorarse sobre la capacidad de volteo que poseen. La aplicación conjunta de inyectables y pour on puede eventualmente ser también una opción, siempre que no se traten de los mismos principios activos o sean moléculas con el mismo mecanismo de acción. En conclusión, los tratamientos para despacho de animales con destino distinto a la faena deben realizarse con suficiente anticipación y funcionarán según lo esperado, en relación a la sensibilidad de la población de garrapatas del campo a uno o varios principios activos utilizados. Así, los productos más eficaces suelen ser los utilizados en forma de balneación, al actuar en forma de contacto directo. El resto de los PVG (pour on o inyectables) actúan por ingestión (cuando la garrapata se alimenta) y es necesario un cierto tiempo para conseguir la letalidad adecuada. También, deben considerarse los tiempos de espera para realizar las revisaciones que demuestren el resultado obtenido. De acuerdo a la variedad de PVG aprobados para su uso, se pueden establecer los siguientes plazos de revisión: - Amidinas (amitraz), piretroides o mezclas piretroides-fosforados deben revisarse 5 días después del segundo baño. - Lactonas macrociclicas (avermectinas) y fipronil como monodroga (o en mezclas comerciales) deben revisarse entre los 7 a 10 días posteriores a la aplicación, según su poder de volteo. - Fluralaner tiene un período de espera para inspección de 10 días. El fluazurón no se considera un producto apto para su utilización en procedimientos de limpieza. Se recomienda organizar las tareas con anticipación al despacho, teniendo en cuenta que cuando se aplica un tratamiento garrapaticida se debe esperar un tiempo prudente para que el producto actúe. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 17 �Los tiempos de espera para la inspección del animal deben respetarse o se estará haciendo una lectura errónea del efecto ixodicida. Uso de productos veterinarios garrapaticidas distintos de balneación Los factores que se deberán tener en cuenta cuando se aplican productos pour on (derrame dorsal) e inyectables son los siguientes: • Utilizar solo PVG aprobados por el Senasa. • Respetar estrictamente las recomendaciones de uso del laboratorio elaborador. • Realizar el pesaje de la totalidad del lote de los animales para tratar (en caso de que sean pocos). • Tratar la totalidad del lote o potrero. • Trabajar a manga cerrada y de forma pausada para una correcta aplicación. • Evitar la sub y sobredosificación de los animales. • Aplicar el producto a conciencia. • En el caso de inyectables, desinfectar entre cada aplicación y verificar que la jeringa esté bien regulada. • En el caso de pour on, aplicar sin apuros y con cuidado para no perder producto (no aplicar en días de lluvia o pronóstico de la misma). Previo a la implementación de un cronograma de tratamientos, realizar un bioensayo para evitar fallas en la eficacia del PVG. Uso racional de los PVG El control integrado de garrapatas engloba muchas herramientas; entre ellas, se encuentran el uso racional estratégico y táctico de los PVG dentro del plan sanitario de un establecimiento, diseñado de acuerdo a las condiciones agroecológicas de la zona a lo largo del año y las generaciones de garrapatas presentes en la región. Por uso racional de productos veterinarios garrapaticidas se entiende la correcta selección de los productos veterinarios (según la familia de principios activos), aplicado a un plan sanitario para el control de la garrapata, en el cual se respetan las dosis, vías e indicaciones de uso, considerando al mismo tiempo la alternancia o rotación necesaria del PVG a lo largo del tiempo. Esta variación del producto dependerá del seguimiento de eficacia de los trata- USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 18 �mientos realizados y los diferentes mecanismos de acción. Como resultado, se promueve la máxima extensión de los plazos hasta la aparición de cepas resistentes a las distintas moléculas, preservando los PVG y previniendo la aparición de residuos químicos en los productos cárnicos y lácteos, que atentan contra la inocuidad de los alimentos. Es esencial contar, por un lado, con un bioensayo previo a la selección de los productos que se utilizarán y, por el otro, con un asesoramiento profesional veterinario para el diseño, implementación y seguimiento del plan sanitario para realizar, bajo un control integrado de garrapata en cada establecimiento productivo. Planificación de los tratamientos El propietario de un establecimiento o responsable de los animales, en conjunto con el veterinario asesor sanitario, debe llevar adelante una planificación adecuada. a. Diseñar el plan sanitario anual para los tratamientos garrapaticidas, considerando: • La historia zootécnica del establecimiento y de aplicación de productos. • La rotación de los principios activos, con diferente mecanismo de acción y diferente vía de administración, según la evaluación de la eficacia de los productos ya aplicados (bioensayo). • La bioecología del parásito en la zona donde se encuentra el establecimiento. b. Considerar la realización de un bioensayo antes de la elección de los PVG que se aplicarán, siempre y cuando se puedan recolectar las garrapatas necesarias para ello. c. Gestionar un plan sanitario asociado al control de la garrapata que debe abarcar, al menos, un (1) año calendario e incorporar la menor cantidad de tratamientos posibles. d. Para el caso de los tratamientos garrapaticidas por baños de inmersión: • realizar una correcta cubicación del bañadero de inmersión; • garantizar el uso de la técnica y la preparación correcta, según indicaciones de uso del laboratorio; • considerar el tiempo de inmersión de los animales para un trata- USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 19 �miento adecuado; • respetar la cantidad de pasajes de animales en cada preparación, hasta la reposición y refuerzo del producto (frecuencia de recambio). e. Garantizar la correcta dosificación por animal y el uso estratégico en el caso de los productos inyectables, pour on u otro tipo de aplicación, en conjunto con los baños. f. Planificar los tratamientos endectocidas y de otros ectoparásitos dentro de un plan sanitario, ya que comparten moléculas que afectan a las garrapatas. Por ejemplo, la familia de lactonas macrociclicas, piretroides y fosforados, entre otros (tratamiento químico integrado). g. Seleccionar el PVG y el tipo de aplicación que se realizará según el establecimiento involucrado (disponibilidad de instalaciones), las condiciones agroecológicas (estación del año, temperatura, humedad y nivel de precipitaciones) y el objetivo sanitario (erradicación, control o limpieza de tropas). h. Respetar las indicaciones de cada PVG, en cuanto a los períodos de retiro a faena o periodo de restricción, a fin de garantizar la inocuidad de los productos cárnicos o lácteos, lo cual se evidencia en el cumplimiento de los límites máximos de residuos (LMR), establecidos en la legislación nacional. i. Adoptar estrategias de control que contemplen la convivencia con niveles parasitarios bajos en establecimientos ubicados en zona endémica. j. Realizar la limpieza total de las tropas, de manera selectiva, cuando sean despachadas hacia zonas sin garrapatas. j. Revisar periódicamente los niveles de eficacia de los tratamientos en el rodeo para evaluar la evolución del estatus sanitario y evidenciar una posible resistencia parasitaria. Evitar los tratamientos parciales y tratar a los animales antes del cambio de potrero k Ante la aparición de fallas en la eficacia en los tratamientos garrapticidas y la posterior confirmación de resistencia parasitaria, realizar un análisis integral del plan sanitario y un rediseño de la estrategia de uso de PVG, en la que se tengan en cuenta el control integrado de garrapatas y la bioecología parasitaria en la zona donde se encuentra el establecimiento. En todos los casos, deben leerse las indicaciones e información provista en los impresos (rótulos) de cada producto, para conocer los cuidados y carencias que deben respetarse. Además, se recuerda que el envío de animales a faena debe realizarse respetando los períodos de carencia de cada principio activo, los cuales pueden ser consultados en cada prospecto del producto veterinario aplicado. Se recomienda complementar la lectura del presente manual con el “Instructivo de toma de muestra de interés en garrapata” y la “Guía de manejo responsable de residuos por el uso de garrapaticidas”. USO CORRECTO DE BAÑADEROS Y PRODUCTOS VETERINARIOS GARRAPATICIDAS 20 �Contacto Programa de Garrapata del Bovino Correo electrónico: garrapatas@senasa.gob.ar Teléfono: (11) 3144-1973 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de procedimiento. Uso correcto de bañaderos y productos veterinarios garrapaticidas Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa de Garrapata del Bovino Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0174 Abstract A summary of the resource. El presente manual está destinado a productores, veterinarios y profesionales del ámbito rural. Esta publicación tiene como propósito informar sobre trata�mientos garrapaticidas prolijos y eficientes, para lograr que el producto apli�cado exprese su máximo potencial de efecto ixodicida sobre la población de garrapatas presente en el animal, minimizando así los tiempos de aparición de la resistencia a las diferentes moléculas. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivo Bañaderos: de inmersión y de aspersión Emplazamiento común Estructura básica común a ambos bañaderos Infraestructura de bañaderos de inmersión Especificaciones Cubicación Elementos Manejo Infraestructura de bañaderos de aspersión Principales características Especificaciones Limpieza de tropas para despacho y protocolos Protocolo con baño de inmersión Protocolo con productos pour on o inyectables Uso de productos veterinarios garrapaticidas distintos de balneación Uso racional de los PVG Planificación de los tratamientos Contacto Enfermedades de los Bovinos Garrapatas https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/5e0c5d5381c068af11b61f8694273086.pdf 22b75ee81f115b49206c3ce15666c2a5 PDF Text Text MANUAL DE USO DE LACOORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO MANUAL PARA EL USO DE LA PLATAFORMA WEBCENTRIX Guía paso a paso para el correcto uso de la plataforma Edición 2024 �Índice Introducción 3 Objetivo 3 Procedimiento 3 1. Ingreso a la plataforma 3 2. Verificar la conexión a internet 3 3. Filtros 4 4. Estado de agentes 5 5. Estado del caso 5 6. Base de conocimiento 5 7. Transferencia de casos 6 8. Tipificar o etiquetar los casos 7 9. Email saliente 8 10. Despedida 9 11. Cerrar los casos que no se están gestionado 11 12. La importancia de cerrar sesión 12 Otros usos de la plataforma para el trabajo diario Edición 2024 12 �Introducción El presente documento describe los lineamientos establecidos para el uso por parte de usuarios internos de la plataforma WebCentrix implementada en el Senasa. Objetivo Brindar asistencia a los usuarios de la plataforma mediante instrucciones necesarias para el correcto uso de la plataforma WebCentrix. Procedimiento 1. Ingreso a la plataforma Para comenzar, ingresar al enlace https://login.wcx.cloud/ con usuario y contraseña. 2. Verificar la conexión a internet Para identificar si la plataforma está recibiendo el ancho de banda mínimo requerido para su normal funcionamiento. Para ello, cliquear en el ícono de WiFi que figura en la barra superior de la plataforma y luego elegir la opción “Últimos eventos”. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 3 �En caso de que el agente cuente con inconvenientes en la conexión a internet, la opción “Últimos eventos” mostrará un listado de las fallas de la conectividad detallando la fecha y hora en la que se detecta el inconveniente y, en caso de corresponder, el número de caso que ha sido afectado. Caso contrario, mostrará que no hubo problemas de conectividad. 3. Filtros Se recomienda usar siempre el filtro “Mis casos sin resolver”. De esta manera se pueden visualizar los casos que cada usuario tiene que resolver y que el sistema le asignó. En una primera instancia, los casos le llegan a los operadores generales (Responde operador 1, Responde operador 3); son estos operadores los que transfieren los casos al resto de los usuarios. Si el operador tiene un caso en su bandeja de entrada, le llegará un correo electrónico. Recordatorio: Responde operador 1 y Responde operador 3 son los usuarios que utilizan los operadores de la CDeIC. Ocasionalmente, cuando hay mucha demanda de atención, también utilizan Responde operador 4. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 4 �4. Estado de agentes Los estados permiten indicarle a la plataforma en qué momento el agente se encuentra habilitado para atender. • Disponible: es el estado que habilita a la plataforma a asignar casos al agente. • No disponible: estos estados imposibilitan la asignación de casos, dado que indican que el agente no está disponible para gestionar. • Invisible: este estado tiene el mismo funcionamiento que los estados de color rojo. Si el estado es no disponible (rojo) o invisible (gris) no se realiza la transferencia del caso ya que no hay certeza de disponibilidad. 5. Estado del caso Se recomienda usar los siguientes estados: • ABIERTO: el caso no se gestionó y requiere atención. • CERRADO: el caso se gestionó y se resolvió. Existen otros estados, por ejemplo: • RESUELTO: una vez gestionada la consulta, se puede seleccionar esta opción, sin embargo, es importante tener en cuenta que el sistema necesita que el caso se encuentre CERRADO para que las métricas estén al día. • ESPERA (Cliente): Una vez trasferido el caso va a permanecer en la bandeja de entrada en el estado “Espera de cliente” para su gestión. De esta manera se va a poder continuar con la conversación. 6. Base de conocimiento Una base de conocimiento es una herramienta interna que nos brinda la plataforma Wise. Contiene información y datos sobre diferentes temas, los cuales se desprenden de las consultas más recurrentes de los diversos públicos del Senasa. Se utiliza para agilizar la atención ciudadana. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 5 �¿Cómo acceder? Iniciada la conversación, podemos utilizar plantillas para responder consultas. Se accede a la base de conocimiento escribiendo @ en el cuerpo de texto. Se selecciona la plantilla y automáticamente aparece el texto en el cuerpo del mensaje. En la Guía de apoyo para operadores de WhatsApp se encuentran las plantillas vigentes para consulta. Los operadores pueden sugerir plantillas para continuar alimentando la base a través de responde@senasa.gob.ar 7. Transferencia de casos Si lo que necesitamos es derivar un caso a otro operador, debemos usar la opción “Transferir”, que se ubica en el mismo apartado inferior del caso donde se encuentran Nota, Recordatorio e Email saliente: MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 6 �Si el operador recibe un caso que no es de su competencia, puede transferirlo al usuario que corresponda o a los operadores generales: Responde operador 1 y Responder operador 3. A continuación, aparecerá una lista con todos los operadores. Allí, el color verde da referencia al estado de conexión del mismo, luego seleccionar el usuario y la transferencia estará completa (un cartel verde en el margen inferior derecho indicará esto con la leyenda “Transferencia correcta”). 8. Tipificar o etiquetar los casos Las etiquetas sirven para señalar información genérica sobre el caso. Mientras que el tipo identifica el motivo de la consulta del cliente. Ambos sirven para aportar mayor información sobre los casos y facilitar los reportes que puede brindarnos el Analytics. De esta manera podemos ver, por ejemplo, cuales fueron mensualmente las consultas con mayor demanda. Una vez tipificado el caso, se cierra, cambiando su estado de abierto a cerrado. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 7 �9. E-mail saliente Esta herramienta se utiliza cuando el usuario abandonó la conversación o se interrumpió. Si es un WhatsApp, pasadas las 24 horas de su ingreso cliquear en “Cancelar”, luego en la pluma y seleccionar “E-mail saliente”. En “Destinatario” introducir el correo electrónico del usuario. Luego, en el cuerpo del mensaje se puede utilizar la plantilla @chatsuspendido. La plantilla predeterminada es parte de la base de conocimiento y ayudará a realizar este tipo de gestiones con mayor rapidez. Recordatorio: para acceder a las plantillas se tiene que escribir “@” y luego la palabra en minúscula. Por ejemplo, @chatsuspendido MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 8 �10. Despedida Al finalizar la conversación, es importante utilizar la plantilla @despedida. La misma es predeterminada y automáticamente se envía la encuesta de satisfacción de atención a la persona que se contactó. Para continuar con una atención personalizada, cada operador deberá firmar con su nombre al despedirse. Notas: La plataforma de WebCentrix posibilita registrar notas en los casos. Estas serán de uso exclusivamente interno, es decir, solo serán visibles para los usuarios de la plataforma. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 9 �En la parte inferior del caso, figuran las siguientes opciones: Haciendo click en “Nota” se ingresa a un campo de texto, donde podemos escribir lo que consideremos de relevancia en ese caso. Una vez escrita la información, guardamos la nota. La nota guardada se va a visualizar de la siguiente manera: MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 10 �Acceso histórico de casos Al abrir un caso podemos acceder al “Histórico”. Se trata de un resumen donde se pueden leer los casos de ese usuario, cuando se comunicó, el motivo de la consulta y las conversaciones que se mantuvieron con los operadores. Este recurso puede ayudar a resolver una consulta, si la persona se comunicó previamente. El “Histórico” va a agrupar los casos cuyos campos identificatorios de la persona que se comunicó se encuentren completos (email, nombre, teléfono). Por ejemplo, si dos casos distintos están registrados bajo el mismo correo electrónico, la plataforma va a identificar que se trata del mismo usuario y va a compilarlo en el “Histórico“. Si una persona genera dos casos de dos celulares diferentes –o desde dos correos electrónicos– la plataforma no tiene forma de determinar que se trata de la misma persona y los contemplan como dos usuarios distintos. 11. Cerrar los casos que no se están gestionado Al abrir un caso, el sistema genera un acceso directo colocándolo en la barra superior de la plataforma para poder navegar de forma práctica entre los casos que se están gestionando. Mientras un caso se encuentre en la barra superior como acceso directo, el mismo será bloqueado por el agente y la plataforma limitará la edición del mismo por parte de otro agente que lo abra. Por esto, se recomienda cerrar los casos que no se están gestionando para que puedan ser editados por otros agentes. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 11 �12. La importancia de cerrar sesión Finalizada la jornada de atención, chequear en la bandeja que los casos estén etiquetados, tipificados y cerrados. Luego, cambiar el propio estado a “No Disponible” y cerrar sesión. Es importante que cada agente cierre la sesión de la plataforma al finalizar su jornada para evitar la asignación de casos mientras no se encuentra operativo. Otros usos de la plataforma para el trabajo diario Otras opciones para aprovechar el uso de la plataforma son Registros y Contactos. En el caso de querer un registro accesible a todas las atenciones (presenciales, telefónicas, correos) la plataforma cuenta con un sistema de creación de casos por tickets en el cual se pueden dejar asentadas todas las conversaciones y una lista de contactos. A través de la opción “Nuevo” que se encuentra ubicada en la barra superior a la derecha, se puede generar un nuevo caso saliente desde los canales configurados. Esta opción permite registrar el trabajo diario de cada operador. Haciendo click, se habilitará un desplegable con los canales habilitados para elegir a través de cuál crear el nuevo ticket. El canal para seleccionar es el de “E-mail saliente”. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 12 �A continuación, se habilitará un recuadro donde se podrán hacer las siguientes acciones: • Seleccionar un contacto existente: por defecto aparecerá el contacto que corresponde al último caso que se haya abierto. Si es necesario, se puede buscar un contacto existente desde el buscador. • Agregar un nuevo contacto. • Elegir el grupo de atención desde el cual se enviará el caso. En la barra que se encuentra debajo de “Nuevo caso”, se podrá filtrar por correo electrónico si el contacto es existente. También, se le podrá asignar un Grupo de Atención, por ejemplo, “Siap Operadores Generales”. De esta manera, ese contacto estará en la lista de contactos de ese grupo. Si el contacto no se encuentra registrado, puede ser creado cliqueando en la de la bandeja principal: MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 13 �A continuación, cliquear en “Nuevo Contacto”. Luego de completar los datos solicitados, se puede guardar y crear el contacto: Si se requiere bajar una copia de la conversación con el usuario, existe la posibilidad de hacerlo desde la opción “Imprimir caso” en “Detalle del caso”. MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 14 �El caso se va a visualizar de la siguiente manera: Haciendo click en “imprimir”, se podrá Guardar en pdf la conversación o imprimirla. En el caso de necesitar un reporte de los casos atendidos, escribir a los agentes Alexander Sothmann (1148891863) o Celeste Marciano (1140512518). MANUAL DE USO DE LA COORDINACIÓN DE DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN AL CIUDADANO 15 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual para el uso de la plataforma webcentrix Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0173 Abstract A summary of the resource. El presente documento describe los lineamientos establecidos para el uso por parte de usuarios internos de la plataforma WebCentrix implementada en el Senasa. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivo Procedimiento 1. Ingreso a la plataforma 2. Verificar la conexión a internet 3. Filtros 4. Estado de agentes 5. Estado del caso 6. Base de conocimiento 7. Transferencia de casos 8. Tipificar o etiquetar los casos 9. Email saliente 10. Despedida 11. Cerrar los casos que no se están gestionado 12. La importancia de cerrar sesión Otros usos de la plataforma para el trabajo diario