1 10 9 https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/16a268a7cdf337e94e3457c24af9dbff.pdf 27195d937b6224e692ac91ffe39752f7 PDF Text Text INSTRUCTIVO Certificado de Seronegatividad para el movimiento (CSM) Procedimiento para veterinarios acreditados en brucelosis bovina �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa Nacional de Brucelosis Bovina Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2026 �Introducción El presente instructivo tiene como objetivo facilitar el procedimiento para generar el Certificado de Seronegatividad para el Movimiento (CSM) de categorías susceptibles a la brucelosis bovina. El CSM deberá vincularse al Documento de Tránsito electrónico (DT-e) para el movimiento y se gestionará a través de los sistemas informáticos del Senasa. Alcances El CSM será requerido cuando el movimiento de los animales involucre a las categorías vaca, toro y torito, y sean trasladados a un Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (Renspa) de destino categorizado como tam­bo, cabaña, cría, ciclo completo y genética. Este requisito se encuentra contemplado en la Resolución Senasa N.° 67/2019. Destinatarios El documento está dirigido a productores, titulares de establecimientos y, principalmente, veterinarios acreditados en brucelosis bovina, quienes son los responsables de realizar el procedimiento de gestión del CSM. Procedimiento Inicialmente –previo al movimiento–, el productor/titular del establecimiento deberá contactar a su veterinario acreditado e informarle que se realizará un movimiento de vacas, toros y/o toritos a un Renspa de destino y que se requerirá el CSM. Posteriormente, el veterinario particular (acreditado) deberá asistir al rodeo para realizar la toma de muestras serológicas de los bovinos identificados para el movimiento y la remisión de las mismas al laboratorio de red para su diagnóstico. Finalizado el procedimiento de muestreo, el acreditado deberá cargar el protocolo de envío de muestras en el SIGATM. Para ello, deberá ingresar al sitio web de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero con su CUIT y clave fiscal. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 3 �Allí deberá contar con el servicio del Senasa “SIGATM” vinculado. De lo contrario, se deberá buscar en la página principal el servicio y luego hacer clic en el botón “Agregar”. Una vez vinculado, el usuario podrá acceder al SIGATM a través del botón visualizado en “Mis Servicios”. Se recuerda que, al momento de ingresar al SIGATM, el veterinario o técnico debe contar con alguna acreditación vigente (en este caso, la de brucelosis bovina). De lo contario, el sistema no permitirá el ingreso. Carga en el sistema Un vez que haya ingresado, el acreditado deberá dirigirse al apartado “Actas DNSA” y generar “Nueva Acta”. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 4 �Allí, en el apartado “Área” –botón desplegable–, se deberá seleccionar el “Programa de Brucelosis”; en el campo “Motivo”, se deberá ingresar Muestreo de brucelosis bovina; y en el de “Submotivo”, se deberá señalar la leyenda “Control de Seronegatividad para El Movimiento (CSM)”. También se deberá registrar la fecha de la toma de muestras (los demás campos se completarán automáticamente). Posteriormente, en el menú desplegable “Lugar de Toma de Muestras” se deberá elegir la opción “Unidad productiva”. Si posee el número de Renspa, se deberá agregarlo en el espacio indicado y hacer clic en el ícono . Luego, se desplegarán automáticamente los datos asociados al registro. Si se desconoce el número de Renspa o existen dudas sobre el mismo, hacer clic en el ícono . El sistema abrirá un buscador que permite indicar el nombre del campo, del titular, o parte del número de Renspa. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 5 �Al finalizar, el sistema arrojará los datos del establecimiento. Verificar que los mismos sean correctos. A continuación, completar la Naturaleza del lote o muestra, indicando la especie y la matriz correspondiente al tipo de muestra. Se deberá cargar la especie “Bovino” y la matriz “Suero”. Luego, se procederá a cargar los datos correspondientes a las muestras. El acreditado deberá tildar la opción “Muestras y submuestras” y hacer clic en el botón azul “Agregar Muestra”. Esta opción permite la carga de muestras de manera individual (una a la vez). Para detallar los datos solicitados de cada muestra, se abrirá un cuadro denominado “Ítem de muestra”. El usuario deberá completar todos los campos y, al finalizar, hacer clic en “Grabar”. Consideraciones • En “datos de recolección”, indicar “Muestra individual”. • En “número de tubos”, ingresar 1. • En “animal muestreado”, ingresar “No Aplica”. • En “tipo de identificación”, seleccionar “Caravana” y detallar en el campo “identificador” el número oficial de la misma. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 6 �* Los campos marcados con asteriscos son obligatorios. Carga de múltiples muestras Esta opción permite la carga de las muestras a través de una plantilla de Excel, lo cual resulta útil para simplificar el trabajo cuando se trata de muchos bovinos. Para iniciar el proceso, se deberán descargar las siguientes dos plantillas que se visualizan en pantalla: • “Descargar plantilla para incorporar muestras (xls)”. • “Códigos para completar la plantilla de muestras (xls)”. Este documento es necesario para elaborar la planilla anterior. En la plantilla de muestras, utilizando los códigos correspondientes, el usuario deberá registrar los datos solicitados de los animales muestreados y cargar el archivo en el sistema. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 7 �Posteriormente, se deberá registrar el ensayo. Allí indicará en el menú desplegable “Grupo de análisis”, la opción Diagnóstico de brucelosis. Luego, el acreditado deberá tildar las pruebas solicitadas (BPAT y FPA) o aquellas que el laboratorio realice y hacer clic en el botón “Asignar”. Para concluir, el usuario deberá indicar el laboratorio de destino para el procesamiento de las muestras y, si todos los datos están correctos, ingresar el botón “Finalizar”. Visualización de actas En el menú principal se podrán consultar las actas finalizadas o aquellas grabadas que se encuentran en estado de preparación (borrador). INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 8 �Registro de resultados en el SIGSA Acceso al sistema Una vez que el laboratorio procesó la muestra y emitió el resultado, el veterinario acreditado deberá registrar el mismo en el Sistema Integrado de Gestión de Sanidad Animal (SIGSA). Para ello, deberá ingresar en la página web de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero con su CUIT con su CUIT y clave fiscal. El usuario deberá contar con el servicio del Senasa “Sigsa” vinculado. De lo contrario, se deberá buscar en la página principal el servicio y luego hacer clic en el botón “Agregar”. Una vez vinculado, el usuario podrá acceder al SIGSA a través del botón visualizado en “Mis Servicios”. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 9 �Se recuerda que, al momento de ingresar al SIGSA, el veterinario o técnico debe contar con alguna acreditación vigente (en este caso, la de brucelosis bovina). De lo contario, el sistema no permitirá el ingreso. Carga de resultados Al ingresar en el SISGA, el acreditado deberá dirigirse al apartado “Sanitario”, ingresar en la opción “Brucelosis” e indicar “Nueva serología”. Allí deberá indicar el número de Renspa de la Unidad Productiva (UP). Luego de que el sistema arroje los datos de la UP, el usuario deberá completar los datos del laboratorio seleccionado e indicar en el apartado motivo la opción “Cert. Serológico para el Movimiento (emisión DT-e)”. Entre otros datos solicitados, el usuario deberá completar el número de protocolo, las fechas de toma de muestra y de diagnóstico, completar la columna “Cant. Negativos” y luego ingresar el botón “Generar”. En caso de haber positivos animales positivos, se deberá completar la columna que solicite esa información, el apartado de “caravanas positivas” (asociadas al animal infectado) e iniciar los procedimientos de saneamientos definidos por la Resolución Senasa N.° 67/2019. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 10 �Al cargar en el SIGSA el resultado serológico con el motivo indicado, el sistema registrará automáticamente el CSM, el cual quedará disponible hasta el momento que sea utilizado en el DT-e para el movimiento. Cuando el productor por autogestión proceda a gestionar el DT-e deberá seleccionar dicho CSM. Procedimiento para la emisión del DT-e El titular del establecimiento deberá ingresar al sitio web de ARCA con su CUIT y clave fiscal, y dirigirse al servicio SIGSA. Allí deberá ingresar con el perfil de “Productor Agropecuario”. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 11 �Luego, deberá ingresar al apartado “Movimientos” y seleccionar “Nuevo movimiento”, indicando como motivo invernada o reproducción al tratarse de un traslado de establecimiento a establecimiento. Allí se deberá indicar la información de ambas unidades productivas, tanto de origen como de destino. Posteriormente, el usuario deberá ingresar la cantidad de bovinos que se van movilizar. Si se van a trasladar categorías vacas, toros y/o toritos y su destino tiene la actividad tambo, cría, ciclo completo, cabaña o genética, el SIGSA solicitará el Certificado de Seronegatividad para el Movimiento (CSM). Allí, el productor deberá tildar la opción requerida y continuar con la emisión del DT-e. INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 12 �Nota aclaratoria • El CSM tiene una validez de 60 días desde la fecha de toma de muestra. • Si la cantidad que se moverá es mayor a la certificada por el veterinario acreditado, el sistema no permitirá continuar con la emisión del DT-e. • Si la cantidad que se moverá es menor a la certificación por el veterinario acreditado, el resto le quedará como remanente para otro movimiento, siempre que este se realice dentro de los 60 días desde la toma de muestra. • Si el veterinario acreditado en brucelosis bovina tiene vencida su acreditación no podrá realizar el CSM, generar el protocolo ni ingresar al SIGSA para registrar la serología. Deberá acreditarse nuevamente para cumplimentar con las tareas sanitarias. Contactos Para mayor información o consultas específicas, comunicarse con el Programa Nacional de Brucelosis Bovina del Senasa a través de: • Correo electrónico: brucelosisbovina@senasa.gob.ar • Teléfono interno: (11) 4121-5410 INSTRUCTIVO. CERTIFICADO DE SERONEGATIVIDAD PARA EL MOVIMIENTO (CSM) 13 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Instructivo. Certificado de seronegatividad para el movimiento (CSM). Procedimiento para veterinarios acreditados en brucelosis bovina Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2026 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa Nacional de Brucelosis Bovina Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Relation A related resource Resolución Senasa N° 67/2019 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0191 Abstract A summary of the resource. El presente instructivo tiene como objetivo facilitar el procedimiento para generar el Certificado de Seronegatividad para el Movimiento (CSM) de categorías susceptibles a la brucelosis bovina. El CSM deberá vincularse al Documento de Tránsito electrónico (DT-e) para el movimiento y se gestionará a través de los sistemas informáticos del Senasa. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Alcances Destinatarios Procedimiento Carga en el sistema Carga de múltiples muestras Visualización de actas Registro de resultados en el SIGSA Acceso al sistema Carga de resultados Procedimiento para la emisión del DT-e Nota aclaratoria Contactos Brucelosis Toma de muestras Veterinarios https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/39dd1833ac756eae39d3ff2b017fe40c.pdf 580cb04112f0314058bcc462b2431d2d PDF Text Text MANUAL DE PROCEDIMIENTO Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) Edición 2025 �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 6 Objetivos 6 Abreviaturas y definiciones 6 Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio 7 Principios de bioseguridad 7 Prácticas operativas seguras y hábitos personales 8 Limpieza y desinfección del laboratorio 10 Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) 10 Aseguramiento de la calidad en el laboratorio 10 Control de calidad de insumos 11 Equipos 13 Sobre la enfermedad 13 Descripción de la enfermedad 14 Infección por Brucella en ganado bovino 14 Infección por Brucella en ovejas y cabras 15 Infección por Brucella en cerdos 15 Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes 16 en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red 17 18 18 20 �Registro de entrada de muestras 20 Características y condiciones de las muestras 21 Condiciones de recepción de las muestras 21 Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las 21 muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) 22 23 para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo 23 Ejecución del ensayo de BPAT 23 Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala 24 Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de scree- 25 ning con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) 25 26 Desarrollo 26 Ejecución del ensayo 27 Incubación 28 Lectura e interpretación de resultados 28 Informes de resultados 30 Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME 31 Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos 31 Desarrollo 32 Toma de la muestra 33 Ejecución del ensayo 33 Lectura 33 Modificación de la prueba para tanques muy grandes 34 Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) 34 Etapas 35 Desarrollo 36 �ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos 38 38 41 contra brucella en suero Desarrollo 42 Ejecución del ensayo 42 Lectura e interpretación 43 Fijación de complemento 44 Desarrollo 44 Manejo y conservación de las muestras 45 Condiciones del ensayo 46 Ejecución 46 Lectura de resultados 48 Anexos 52 Bibliografía 68 �Introducción El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Estas técnicas son internacionalmente reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Objetivos • Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Redlab. • Proporcionar a la Redlab un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. • Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse cuando se desarrolle un procedimiento técnico. • Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Abreviaturas y definiciones • Ag: Antígeno • Biovariedad: bv • BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en placa • CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo • C’: Complemento de cobayo • DGLYCT: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico • DLA: Dirección de Laboratorio Animal • DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal • DT: Dilución de Trabajo • ELISA: Enzimoinmunoensayo • FCT: Fijación de Complemento Test • FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente • GR: Glóbulos Rojos • IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto • IgG: Inmunoglobulina G • IgM: Inmunoglobulina M • LPS: Lipopolisacárido • 2-ME: 2- Mercaptoethanol • M: Molar • mP: milipolarización MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 6 �• MRT (PAL): Prueba de anillo en leche • OMSA: Organización Mundial de Sanidad Animal • PAC: Poder anticomplementario • RBT: Rosa de Bengala Test • Renspa: Registro Nacional de Productores Agropecuarios • SAT: Seroaglutinación lenta en tubo • SB: Solución Buffer • Senasa: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria • SH: Sistema Hemolítico • UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro • UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro • UA: Unidad de Antígeno • UC: Unidad de Complemento • UH: Unidad de Hemolisina Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Se entiende por bioseguridad: La disciplina que trata el manejo seguro y la contención de microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos. La práctica del manejo seguro de microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación de los principios de contención y la evaluación de riesgos. Principios de bioseguridad El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos. Contención primaria: la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de Equipos de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de vacunas al personal cuando corresponda puede brindar un mayor nivel de protección del personal. Contención secundaria: la protección del medioambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas operativas. Por lo tanto, los elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Prácticas y técnicas de laboratorio: el elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 7 �estándares. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien informado acerca de las técnicas de laboratorio adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo. Cuando las prácticas de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento. El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del personal. Prácticas operativas seguras y hábitos personales • Limitar o restringir el acceso al laboratorio. • Diseñar el laboratorio para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos. • Seleccionar muebles de laboratorio con capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza. • Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos. • Adecuar la iluminación para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que pueda molestar la visión. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 8 �• Proveer mosquiteros para las ventanas del laboratorio que se abren hacia el exterior (en lo posible deberían ser fijas). • Usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas); además, usar calzado cerrado y cabello recogido. • Es obligatorio el uso de guantes cuando es probable que las manos entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados (puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes). Descartar los guantes cuando están contaminados y retirarlos cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar fuera del laboratorio. • No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo. • Utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial. • Lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I). • Almacenar los alimentos fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados con este único fin. • Está prohibido pipetear con la boca: utilizar dispositivos de pipeteo mecánicos. Aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes. • Llevar a cabo todos los procedimientos con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles. • Descontaminar las superficies de trabajo como mínimo una vez por día, luego de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable. • Descontaminar todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados antes de ser desechados mediante un método aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 9 �y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos. • El laboratorio debe tener las hojas de seguridad1 de cada sustancia química que utiliza en formato impreso y capacitar al personal sobre las mismas. Limpieza y desinfección del laboratorio Todo laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos para disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del lugar y volumen de trabajo. La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas, etc. Dentro de la limpieza se debe incluir el control de insectos y roedores. Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) El laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los residuos peligrosos ya que pueden causar daño, directa o indirectamente a seres vivos o contaminar el suelo, el agua, la atmósfera o el ambiente en general. Se consideran residuos patológicos/químicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a determinadas dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la salud, luego de estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía. Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en el lugar de generación de los mismos. Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: incineración, enterramiento por relleno de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a ese fin. Se ajustará a la normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio. Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (buenas prácticas de laboratorio), requisitos particulares del Senasa y la Norma ISO/IEC 17025 (última versión vigente) según la categoría del laboratorio. Es un documento que indica las particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado (en inglés, Material Safety Data Sheet o MSDS). El principal objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. Esta hoja o ficha contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales. 1 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 10 �Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados. Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser detectados para poder aplicar correcciones o acciones correctivas. Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos con la utilización diaria de sueros controles internos con títulos conocidos; mientras que el control externo –que se refiere al realizado por un laboratorio de referencia– se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad internos implementados. Respecto a la participación en ensayos interlaboratorios, los mismos deben ser provenientes de organismos reconocidos y programas de ensayos de aptitud. Se deben mantener documentados los resultados y, en caso de obtener resultados no satisfactorios, implementar las acciones correctivas pertinentes para su seguimiento y cierre. Del mismo modo podrán utilizarse otras herramientas a los fines de garantizar el desempeño adecuado y asegurar la calidad de los resultados de ensayo, como la confección de gráficos de control2. El control permanente de la calidad de los resultados junto con las buenas prácticas de laboratorio que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantiza el resultado confiable del diagnóstico. Control de calidad de insumos Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben ser establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo. La composición, el tipo de envase, la identificación y el lugar de almacenamiento deben ser los indicados en los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio. Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas. 2 Diagrama que sirve para examinar si un proceso se encuentra en una condición estable, o para asegurar que se mantenga en esa condición. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 11 �Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo deben utilizarse de acuerdo a las especificaciones del manual de procedimientos operativos correspondiente, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación. Los reactivos para el diagnóstico de brucelosis que se comercializan en la República Argentina, deben cumplir la normativa vigente del Senasa y aprobar el control de calidad de cada lote o serie indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de antígeno/kit que se utiliza con la fecha de uso. En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o pureza se encuentran establecidos sobre la base de diferentes normas o criterios, dependiendo de las instituciones u organismos internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran la American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes niveles de pureza del agua en función de los parámetros físico-químicos, tales como conductividad eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice. Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica. Especificaciones según ISO 3696 Parámetros Fisicoquímicos Grado 1 Grado 2 Grado 3 Conductividad eléctrica valor máximo a 25 ºC, µS/cm 0,1 1 5 Resistividad, MΩ 10 1 0,25 Absorbancia (UA a 254 nm) 0,001 0,01 -- Sílice Total valos máximo mg/l 0,01 0,02 1 pH -- -- 5,0 a 7,5 Clasificación de los tipos de agua según NC-ISO 3696: 2004 Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más exigentes, incluyendo la cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de una membrana con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice fundido). Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para análisis delicados, incluyendo la espectrometría de absorción atómica (EAA) y la determinación de componentes en cantidades mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u osmosis inversa seguida de destilación. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 12 �Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la preparación de soluciones de reactivos. Se puede preparar mediante una sola destilación, por desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo normal de análisis. Equipos El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el laboratorio. El equipamiento que afecte la calidad de los resultados de ensayo, debe mantenerse controlado, estipulando dentro de un programa los intervalos de control, calibración /verificación y mantenimiento de los mismos. Sobre la enfermedad3 Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones–humanas o animales– causadas por distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis) del manual de la OMSA. Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis) El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden Rhizobiales, en la clase alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la reaprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos relacionados con las seis especies de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las Fuente: Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad Animal -OMSA)- versión 2022. 3 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 13 �tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el reservorio natural de las mismas. Si bien solo se han descrito dos cepas de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado como nuevas especies de Brucella. Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción del microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo se encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos machos adultos pueden presentar orquitis/epididimitis y la brucelosis puede ser una causa de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por Brucella. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 14 �Infección por Brucella en ovejas y cabras La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causada principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva Zelanda. Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales de transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988). Infección por Brucella en cerdos La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B. suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis, pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis porcina puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de jabalíes. En general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la cópula también es frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días 50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infecMANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 15 �tados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones, cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6 meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al., 2012). La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en jabalíes parece ser alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares, sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres. Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos. Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis. Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano y el europeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el ganado bovino, ovino y caprino. La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje) se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos antropogénicos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 16 �Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son el hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por cohabitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y los caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microorganismos similares a B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado que son distintas de B. suis en función del perfil genético. Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos de tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor; a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden desarrollarse en casi cualquier lugar, a veces en el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos signos locales, como aborto, retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno, especialmente la médula ósea. Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Ciertas especies de Brucella, sobre todo B. melitensis, B. abortus, B. suis –y probablemente en menor medida B. canis– son fácilmente transmisibles al ser humano, en el que causan un proceso febril (fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones graves que afecten a los sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central. Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos constituye el principal riesgo para el MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 17 �público general en los lugares en los que la enfermedad es endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del riesgo biológico. Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS, 1953; OMS, 2004). Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos. Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos. Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se describen en este manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin embargo, los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico. Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FCT) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el ensayo de polarización fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 18 �En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado. Tabla 1 Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus, melitensis o suis (Manual OMSA, 2022). Propósito Método Demostrar ausencia de infección en la población Demostrar ausencia de infección en animales individualesa Contribuir a las políticas de erradicaciónb Confirmar casos clínicos sospechososc Determinar la prevalencia de la infección – vigilancia en el rebaño / manada Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones tras la vacunación - - Identificación del agente Métodos de tinción - Cultivo PCRd - - + +++ +/++ Detección de la respuesta inmune BBAT (RBT o BPAT) +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + +++ + +++ +++ + + + + ++ ++ ++ + +++ - +++ ++ +++ +++ ++ ++ + - Pruebas basadas en el NH y proteínas del citosole - - + ++ - - Prueba en leche de tanquef I- ELISA en leche o prueba de anillo en leche +++ - +++ + +++ - FPA CFT I-ELISA C-ELISA BST SAT Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad u otros factores limitan su aplicación; - = no adecuado para esta finalidad. PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de bengala] y BPAT [prueba de aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA = enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina; SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 19 �a Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por Brucella. b Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/ manadas, se recomienda combinar pruebas para aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o I- ELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST. c En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal. En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso en ausencia de signos clínicos. En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o BST. En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST. d Es posible que se obtenga falsos positivos. e En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev. 1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección. f Solo ganado lechero. Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y rechazo de muestras. Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta identificación, embalaje y documentación que acompaña a las mismas. Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con back- up), en el que figure como mínimo la siguiente información: • Fecha de recepción de muestras. • Cantidad de muestras. • Especie. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 20 �• Fecha de extracción de muestras. • Procedencia: establecimiento, número de Renspa. • Localidad: departamento, partido, provincia. • Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa. • Motivo del envío: • DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario). • MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus). • SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el Movimiento). • Control interno (según requerimiento de veterinario acreditado). • Remuestreo, otros. Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras: • Sangre entera o suero refrigerados • Suero congelado • Leche para PAL refrigerada (no congelada) • Leche para IELISA refrigerada/congelada • Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo • Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras: • Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) • Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la toma de muestra • Sangre entera congelada • Leche para PAL congelada, contaminada • Sangre entera o suero, contaminados • Sueros hemolizados • Tubos no identificados • Volumen insuficiente Los laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 21 �Informes de resultados Los informes que elabore el laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar adecuadamente las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo I del presente manual). En el informe de resultados debe constar: • Logo del laboratorio/Dirección/Tel./e-mail/ Número de identificación del laboratorio • N.° de protocolo interno • Fecha de extracción de muestras • Fecha de recepción de muestras • Fecha de informe o emisión de resultados • Cantidad de muestras • Especie • Procedencia: establecimiento, número de Renspa • Localidad: Departamento, partido, provincia • Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa • Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus), SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el movimiento), control interno (según requerimiento de veterinario acreditado), remuestreo • Columnas con la información del tubo / caravanas / edad / fecha de vacunación / pruebas utilizadas / resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME, ELISA, FCT, FPA), valor de corte e interpretación cuando corresponda • Información de los antígenos / kits utilizados • Firma del director técnico del laboratorio • Observaciones • Paginación x de y • Que conste en todas las páginas N.° del protocolo y N.° de Renspa Animales para examinar: Hembras vacunadas mayores de 18 meses y animales no vacunados mayores de 6 meses. Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de brucelosis en la República Argentina. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 22 �Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos IgM específicos. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio marcada con cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente. • La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para evitar la evaporación de las muestras. • Mezcladores de acero o plástico. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 º C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 ° C). • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. Reactivos: • Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%. • Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%. • Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Suero control interno positivo. • Suero control interno negativo. • Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Ejecución del ensayo de BPAT • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). • Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de ambos lados de la misma. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 23 �• Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 µl de suero, previo mezclado con vórtex. Utilizar un tip o punta de pipeta para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno. • Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro. • Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeneizar la mezcla. • Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa, permaneciendo la luz apagada. • Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos. A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura. Figura 2: Aglutinoscopio. Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala • Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT. • Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 µl de suero. Utilizar un tip para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero. • Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno, abarcando una superficie circular de aproximadamente 2 cm de diámetro. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 24 �• Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente. • Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco. En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OMSA recomienda utilizar la prueba de Rosa de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno. Lectura a los 4 minutos, como se detalla en la explicación anterior. Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aun siendo finos (no confundir con aglutinaciones inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de SAT / 2-ME, FPA, ELISA o FCT. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos. Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias. + - + Figura 3: Lectura BPAT/RBT - Informes de resultados Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas: Positivo Negativo + - POS NEG P N MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 25 �Criterios de aceptación del resultado En paralelo a las muestras problema se dispensan los sueros controles internos negativos y positivos. Para aceptar los resultados, ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si los controles no arrojan la lectura esperada, se deben revisar las posibles causas, calidad de los sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc. Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión. El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que causa un determinado grado de aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución. La prueba de 2-mercaptoethanol (2-ME) es una prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2-mercaptoethanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aun cuando las subunidades están integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación. La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos de la clase IgG. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente). El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de vidrio. • Probetas (100 ml y 1000 ml). • Pipetas 1, 2, 5 y 10ml. • Recipientes de vidrio de volúmenes variados. • Propipetas. • Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10 ml. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 26 �Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Balanza. • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. • Termómetro calibrado. Reactivos: 1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%.4 2. Suero control interno positivo. 3. Suero control interno negativo. Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Drogas y soluciones5: • Cloruro de sodio p.a. • Fenol p.a. • 2-mercaptoethanol p.a. • Solución salina al 0,85 %. • Solución salina fenolada al 0,5 %. Ejecución del ensayo Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera: • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC al menos una hora antes de la ejecución del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos de 10 minutos (no usar vórtex). • Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8 tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla con el número de protocolo. • Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema. En los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja un espacio libre y en los 4 tubos siguientes de la misma hilera, se realiza la prueba de 2-ME. • Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer tubo, 40 µl se distribuyen en el segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el cuarto. • Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de suero en los tubos de 2-ME. 4 Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar porque esto lo inutiliza al modificar la sensibilidad. 5 Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 27 �• Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo, además de un control de soluciones y antígeno sin suero. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución de 2-ME (0,1 M) en cada tubo de este grupo y mezclar muy bien agitando la gradilla. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución salina fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT. • Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y, posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno de SAT diluido al 2 % (0,09 % de brucelas) en solución salina 0,85 %. • Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa. Consideraciones generales: • Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse por las técnicas de SAT y 2-mercaptoethanol, ELISA, FPA o FCT. • La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación en tubo, no solo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción de la aglutinación específica de la unión antígeno-anticuerpo. Incubación La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 horas y tiene por objeto obtener en el tiempo más corto posible el máximo de aglutinación. Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la estufa durante el transcurso de las 40-48 horas de la incubación, para verificar la estabilidad de la estufa. Lectura e interpretación de resultados Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las pruebas contra el fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz que atraviese los tubos. La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el fondo del tubo por gravedad determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo; después de una leve agitación del tubo, se mantienen los grumos firmes. La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar tanto en la claridad/turbidez de las MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 28 �mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los grumos al agitar suavemente el tubo. El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa aglutinación en el tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la turbidez y los grumos firmes se mantienen a pesar de una agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI / ml de aglutinación en SAT o en 2-ME. El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo (+), incompleto (I) o negativo (-). • Aglutinación completa es aquella en que el líquido de la mezcla suero-antígeno aparece límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos. • Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una suave agitación no rompe los grumos. • Negativa es aquella en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida aparece turbia y una suave agitación no revela grumos. Fenómeno de zona En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas, pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada “fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el suero en las diluciones más bajas, lo que provoca una aglutinación no visible por estar fuera de la zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 29 �Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME. Informes de resultados Ejemplo: Negativo Neg I 25 25 1/25 I: Incompleto Tabla 2 Interpretación de los resultados para hembras bovinas mayores de 18 meses de edad vacunadas con Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH * NH NEGATIVO + ≤ 50 - NEGATIVO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - SOSPECHOSO + I 200 - SOSPECHOSO + 200 - POSITIVO + 25 a 50 I 25 NEGATIVO + ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO + ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO * NH: No se hace MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 30 �Tabla 3 Interpretación de los resultados para animales no vacunados (bovinos y otras especies) mayores de 6 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH NH NEGATIVO + 25 - NEGATIVO + I 50 - SOSPECHOSO + 50 - SOSPECHOSO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - POSITIVO + 200 - POSITIVO + ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Solución salina 0,14 m • Cloruro de sodio 8,5 g • Agua destilada 1000 ml Solución salina fenolada Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. Solución 2-ME 0,1 m • 2-Mercaptoethanol 7,8 ml • Solución salina 0,14 M. 992,2 ml Importante: no utilizar solución salina fenolada El 2-mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire. Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en lo posible con máscara de gases o en cabina de extracción. Nunca pipetear con la boca. La solución de 2-mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una semana a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. • Solución de antígeno SAT (wright) al 2 % • Solución salina 0,14 M (no utilizar solución salina fenolada) 98 ml • Antígeno SAT (wright) (4,5 %) 2 ml MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 31 �La solución de antígeno al 2 % se puede conservar por una semana en heladera (5 ± 3 ºC). Descartar toda aquella solución que presente turbidez o signos de contaminación. Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos La prueba se diseñó para detectar la presencia de anticuerpos en leche de bovinos. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie, de esta manera forma una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural. Esta prueba se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la brucelosis. El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso. Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las pruebas serológicas para identificar aquellos infectados. Desarrollo Materiales: • Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de Khan de vidrio claro y completamente limpio. • Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. • Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml. • Gradillas. • Timer. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Termómetro calibrado. Reactivos: • Antígeno PAL con volumen celular aprox.4 %. • Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Muestras de leche refrigerada (no congelada). • Solución de formalina 1 %. • Muestras de leche controles positivo y negativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 32 �Ejecución del ensayo Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura de 5 ± 3 ºC hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas). No deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta ni conservadas durante más de 72 horas. • Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (no usar vórtex). • Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100 mm o tubo de Khan. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. • Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes. • Incubar en estufa a 37 ± 2 º C, durante una hora. Lectura - Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul. + Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual. ++ Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche. +++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color. ++++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca. Cualquier grado de + debe interpretarse como positivo. Observaciones • El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba. También, la agitación vigorosa dificulta su realización. • El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba no se puede efectuar con leches pasteurizadas. • Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la leche, se pueden obtener algunos resultados falsos positivos o dudosos. • La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos. • La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la interpretación de la prueba debido al descoloramiento del antígeno. • La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos positivos. • Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 33 �Modificación de la prueba para tanques muy grandes Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche manteniendo constante la cantidad del antígeno (30 µl). Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (2 o 3 ml de leche), se añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada al tubo de ensayo y, a continuación, 30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la misma forma que para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis. < 150 vacas 1 ml de leche 150 – 450 vacas 2 ml de leche 451- 700 vacas 3 ml de leche Figura 5: Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras de pool de leche. Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis en la República Argentina con el valor de corte establecido por el Senasa. El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de “señal” que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 34 �hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular. Etapas Previo al inicio de la ejecución del ensayo, equilibrar todos los componentes del kit a temperatura del laboratorio. 1. Adición en cada pocillo de los controles y sueros/leche problemas en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos, estos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 2. Incubación. 3. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o uniones inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del ensayo. 4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti IgG de especie), los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 5. Incubación. 6. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado. 7. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 8. Adición de la solución de frenado. 9. Lectura colorimétrica de la placa. Figura 6: Esquema ELISA indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 35 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450 nm). • Computadora. • Agitador orbital de placas. • Lavador manual o automático de placas. • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 ºC). • Estufa de incubación (37 ± 2 ºC). • Vórtex. • Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada). • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10 µl, 5 - 50 µl, 50 -200 µl, 200 - 1000 µl). • Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl). • Propipetas. • Dispensadores automáticos. • Timer. • Selladores de placas de acetato o parafilm. • Cubetas plásticas para pipetas multicanales. • Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o placas fondo en U. • Criotubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros. • Gradillas. • Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc., de distintos volúmenes). • Toallas o papel absorbente. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa y contienen: • Buffer de lavado • Buffer de dilución • Conjugado • Sustrato cromógeno • Solución de frenado • Sueros controles • Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 36 �Precauciones para tener en cuenta al ejecutar la técnica de Elisa: • Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos. • Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de su utilización. • No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits. • Evitar cualquier contaminación de los reactivos. • No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad. • Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo. • Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación / dilución de los reactivos que se empleen en el ensayo. • Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo. • Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador. • Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice el kit. • El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se recomienda retirar del frasco únicamente el volumen que se vaya a utilizar y nunca devolver el sustrato sobrante al frasco original. • La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la piel lavar inmediatamente con abundante agua. Figura 7: Placa de Elisa. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 37 �ELISA por competición / bloqueo La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una matriz sólida (microplaca de 96 pocillos). A continuación, se añade la dilución de los sueros y el anticuerpo monoclonal, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos junto con el antígeno adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo antimonocolonal conjugado con enzima. Es importante mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero normal (no infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies. La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato/cromógeno. Después de un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos del ensayo la placa debe ser lavada debidamente. En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el anticuerpo monoclonal se liga con el epitope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos anti Brucella (suero positivo), estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epitope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos posvacunales por B. abortus cepa 19 compiten en menor grado con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja, lo que usualmente resulta en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores al sangrado). Diversos CELISA/bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras contengan anticuerpos frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen este tipo de anticuerpos, el conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa. Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato adecuado, el cual desarrollará una reacción colorimétrica en presencia de la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con enzima). De este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra evaluada no contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y la ausencia de color indicará que la muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos. Desarrollo Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación de las muestras: Idem Elisa indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 38 �Figura 8: CELISA. Tabla 4 Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA Señal Posible causa Solución 1. Error de pipeteo 2. Falta de mezcla de reactivos 3. Falta de lavados Práctica Mejorar técnica Precaución 1. Se omitió el substrato 2. Concentración substrato errónea Revisar Revisar 3. Conjugado muy diluido 4. Se omitió el conjugado Revisar Revisar Color parejo en toda la placa 1. Conjugado muy concentrado 2. Falla en el lavado 3. Substrato contaminado Controlar Mejorar técnica Revisar Elevado color de fondo “background” 1. Reacción inespecífica 2. Material de vidrio sucio 3. Agua de mala calidad Cambiar solución de lavado Mejorar lavado Controlar calidad Desarrollo de color muy rápido 1. Substrato muy concentrado 2. Conjugado muy concentrado Revisar Controlar dilución Desarrollo de color muy lento 1. Substrato muy diluido 2. Conjugado muy diluido 3. Concentración cromógeno errónea Revisar Revisar dilución Revisar Efecto borde 1. Incubación despareja 2. Resecación por aire 3. Tampón de lavado residual Utilizar estufa Mantener la placa cubierta Eliminarlo Color irregular No hay color MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 39 �Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 40 �Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero El ensayo de polarización fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella tiene la capacidad de ser una prueba multiespecies, lo que permite el diagnóstico presuntivo en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y bisontes. Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con Brucella de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de los 3 meses posvacunación aproximadamente, y de los animales con reacción cruzada con bacterias gramnegativas en más del 90% de los casos. A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un tubo de vidrio. A continuación, la muestra es equilibrada por aproximadamente cinco minutos, posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador fluorescente para obtener una lectura blanco de referencia (autofluorescente). A continuación, el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) es agregado a la solución y luego la muestra es equilibrada nuevamente por un mínimo de dos minutos para permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen. La muestra es leída nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos anti Brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP. El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina se ha determinado en: Bovinos: • Animales negativos: < 94 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 94 mP y 104 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP. Caprinos y porcinos: • Animales negativos: < 85 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 85 mP. Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis): • Animales negativos: < 80 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 80 mP y 90 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 91 mP. Se modifica el valor de corte en la especie ovina (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis) con una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 95 %. Programa GraphPad Prism. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 41 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de polarización fluorescente. • Vórtex. • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10 µl, 20 –200 µl, 200– 1000 µl). • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 º C). • Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm. • Material de vidrio. • Termómetro de temperatura ambiental. • Computadora e impresora. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa e incluyen: • Buffer de dilución. • Sueros controles positivo y negativo. • Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceína. Ejecución del ensayo Preparación de los reactivos Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial. Preparación del equipamiento/instrumentos El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos los equipos previos a la ejecución del ensayo. Preparación de la prueba En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con lo especificado en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los sueros controles no se ajusta dentro de los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado. Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por lo menos dos (2) horas antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso: • Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 10 µl de suero bovino (dilución 1/100) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex evitando la formación de espuma. • Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex. • Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros. • Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 42 �• Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se estabilice. • Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las muestras. • Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y mezclar bien con vórtex. Es importante evitar la formación de espuma en la muestra. En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas partículas hayan sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas pueden interferir con la lectura de la muestra dado que la misma se basa en el peso molecular de las partículas en suspensión. • Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos minutos. • Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas. Figura 10: Esquema ensayo de polarización fluorescente. Lectura e interpretación Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del kit utilizado según el control de calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo. Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización (mP) de la actividad del suero contra el antígeno. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Aceptación de los controles Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será rechazada y los controles y las muestras deben ser repetidas. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 43 �Fijación de complemento La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional para el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina. La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos “capaces de fijar” el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de “Animal infectado”. La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente. La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera, el antígeno y el suero problema (cuyo complemento se destruyó previamente por calentamiento a baño maría) se incuba en presencia de complemento de cobayo. Después de dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un “sistema indicador” o “sistema hemolítico” formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como complejo antígeno-anticuerpo alternativo. La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmunocomplejos en la primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de sus factores. En la segunda etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante la presencia del “sistema hemolítico”. El resultado es la ausencia de hemólisis (resultado positivo). Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es indicadora de la existencia de complemento libre en la segunda etapa de la reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmunocomplejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo). Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2 %, 2,5 % o al 3 %). Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina) hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100 % de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo. Desarrollo Materiales: • Tubos de ensayo. • Material de vidrio de volúmenes varios. • Gradillas. • Film para cubrir placas. • Puntas de pipetas (tips). • Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. • Cubetas o reservorios de plástico para reactivos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 44 �Equipos: • Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a 5000 µl. • Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl. • Centrífuga. • Centrífuga de placas. • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 °C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Agitador de microplacas. • Vórtex. • Baño térmico. • Espectrofotómetro. Reactivos: • Solución buffer: Ver Anexo FCT I Solución GR 2%: ver Anexo FCT II Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III Sistema hemolítico Anexo FCT IV • Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V Titulación Antígeno: Ver Anexo FCT VI Sueros controles: • Suero control positivo bovino. • Suero control negativo bovino. Manejo y conservación de las muestras • Conservar los sueros en heladera (5 ± 3 º C) no más de dos días, para períodos mayores, conservarlos a –20 ± 5 º C. • Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento. • No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis. • Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos. Inactivación de los sueros Los sueros controles y las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2 ºC para eliminar el complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño termostático se controla mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de exposición de las muestras. - Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre 60 - 63 °C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación de 30 minutos). - Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. Volumen de suero sugerido para inactivar: 200 µl. - La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejan a tem- MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 45 �peratura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 horas, las muestras ya inactivadas se conservan a -20 ± 5 ºC. Condiciones del ensayo El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2 º C) y se utilizan los siguientes reactivos en volúmenes de 25 µl: a. Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB. b. Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100 %). c. Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo. d. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una solución de suero hemolítico en SB que contenga 2UH (100 %) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero en SB al 2 %. Ejecución Dependiendo del número de muestras que se realizarán, se podrán incluir los controles en la misma placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles. Dilución de las muestras de suero El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U, mediante la utilización de volúmenes de 25 μl. La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Suero 25 µl 25 µl de la dilución 1/2 25 µl de la dilución 1/4 25 µl de la dilución 1/8 25 µl de la dilución 1/16 25 µl de la dilución 1/32 25 µl de la dilución 1/64 25 µl de la dilución 1/128 SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl Sueros controles Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización de volúmenes de 25 μl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla en la tabla 2. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 2 1/12,5 1/25 Suero positivo 01/05 25 µl SB - 25 µl 25 µl 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 25 µl de la dilución 1/25 25 µl de la dilución 1/50 25 µl de la dilución 1/100 25 µl de la dilución 1/200 25 µl de la dilución 1/400 25 µl de la dilución 1/800 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 46 �Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.). Controles del ensayo a. Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado en la placa 25 μl/pocillo de SB, 25 μl/pocillo de C y 25 μl/pocillo de antígeno. b. Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 50 μl/pocillo de SB y 25 μl/pocillo de C. c. Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 75 μl/pocillo de SB. Disposición de los sueros en la placa Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo en U (25 µl/pocillo) según indica la tabla 3. Tabla 3 1 Control positivo 2 Control negativo 3 muestra 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/12,5 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 B 1/25 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 C 1/50 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 D 1/100 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 E 1/200 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 F 1/400 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 G 1/800 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 H 1/1600 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento • Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras. • Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control negativo) y 1/12,5 (control positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder anticomplementario (PAC) de cada suero. Primera incubación en caliente • Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Dispensado del sistema hemolítico • Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e incubar a 37 ± 2 ºC durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo FCT IV. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 47 �• Finalizada la primera incubación, dispensar 25 μl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los pocillos de las placas incluida la placa de los controles. Segunda incubación en caliente • Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos o bien dejarla en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura. Lectura de resultados El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos) de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción positiva se cuantificará mediante la determinación del título y su grado de hemólisis. Reacción positiva • Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo. • El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y consignarse mediante un sistema de cruces. Figura 11: Placa fijación de complemento. ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botó de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 48 �Determinación del título del suero Será la inversa de la dilución más alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este grado de fijación será informado mediante el sistema de cruces descripto y convertido a UIFCT. - En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier valor ≥ 40 UIFCT (1/8 ++). - Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo cualquier valor ≥ 20 UIFCT (1/4 ++). Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón internacional OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se basa en el “Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis” (Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia) y el “Manual de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario” (Gobierno de Aragón. España. Tabla 4). Tabla 4 Interpretación en UIFCT Dilución % de Fijación del Complemento 1000 UIFCT (1/200) + ++ +++ ++++ 16,6 20 23,2 26,6 1:8 + ++ +++ ++++ 33,2 40 46,4 53,2 1:16 + ++ +++ ++++ 66,4 80 92,8 106,4 + ++ +++ ++++ 132, 8 160 185,6 212,8 1:64 + ++ +++ ++++ 265,6 320 371,2 425,6 1:128 + ++ +++ ++++ 531,2 640 742,4 851,2 + ++ +++ ++++ 1062,4 1280 1484,8 1702,4 1:4 1:32 1:256 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 49 �Controles del ensayo La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados: Controles Resultado esperado Suero control positivo 50 % de fijación (++) en la dilución 1:200 que corresponde a 1000 UIFCT (Brucellas lisas) Suero control negativo 100 % de hemólisis en todos las diluciones, ausencia de fijación de complemento Control de poder anticomplementario de los sueros 100 % de hemólisis ausencia de fijación del complemento en la dilución 1:2 (sin antígeno) Control de ausencia de poder anticomplementario del antígeno 100 % hemólisis Control del sistema hemolítico sin C 0 % de hemólisis Control del sistema hemolítico con C 100 % de hemólisis Criterio de aceptación del análisis: El ensayo se debe considerar APROBADO/NO APROBADO a) APROBADO: • Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento dan los resultados pre-establecidos. • El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con una variación máxima de (± 2 ++). • El control negativo da un resultado Negativo. b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se repite el ensayo. La presencia de, al menos, un 25 % de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A (dilución ½) indica poder anticomplementario en la muestra. En este caso, se informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción de la toma de muestra. Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar una escala visual del siguiente modo: • En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 900 µl de SB 1X. • En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 700 µl de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR (solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X para mantener la presión osmótica. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 50 �Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0 % de hemólisis y el 100 % de hemólisis en la prueba. De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS Reactivos en µl 0% Solución hemolisada Suspensión de glóbulos rojos 0 100 10 % 10 90 20 % 20 80 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % 80 % 90 % 30 40 50 60 70 80 90 100 60 50 40 30 20 10 0 70 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 100 % 51 �Anexos MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 52 �Anexo FCT I: Solución Buffer (SB) Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1, luego conservar en refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez producto de contaminación. Solución de stock calcio 0,3 M y magnesio 1 M Ca Cl2. Mg 3,7g Cl2. 9,5 g Agua destilada 100 ml • Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85 % (NaCl2 8,5 g/agua destilada 1 litro). • La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 - 7,4. • Luego de su uso, conservar en refrigeración por 7 días. II: Preparación de la suspensión de GR 2 % a) Lavado de los GR 1. Homogeneizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos. 2. En un tubo cónico resuspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5 volúmenes de SB, luego homogeneizar cuidadosamente. 3. Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 4. Repetir la resuspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente descripta y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 5. Realizar la última resuspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 10 minutos. 6. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante, el cual debe estar libre de hemólisis. 7. El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2 % se podrá realizar por medio de dos técnicas. • Método espectrofotométrico. • Método en cámara de Neubauer. Método espectrofotométrico: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5 ml agua destilada en la celda o tubo del espectrofotómetro. 3. Determinar la lisis 100 % de los GR realizando una dilución 1/15 con agua destilada, agregando en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 53 �4. Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm. 5. La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar según el modelo de espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la concentración de GR al 2 %. Método en cámara de Neubauer: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlos en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la cámara. 3. La suspensión deberá tener 5,4 (± 0,2) X 108 GR / ml. III: Titulación Hemolisina Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex. Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina N.° de tubo Dilución SB (ml) Hemolisina 1 1/50 4,9 100 µl 2 1/100 2 2 ml T1 3 1/150 7,45 50 µl 4 1/200 1 1 ml T2 5 1/250 12,5 50 µl 6 1/500 1 1 ml T5 7 1/1000 6 2 ml T5 8 1/2000 1 1 ml T7 9 1/3000 2 1 ml T7 10 1/4000 3 1 ml T7 11 1/5000 4 1 ml T7 12 1/6000 5 1 ml T7 13 1/7000 3 0,5 ml T7 14 1/8000 3,5 0,5 ml T7 15 1/9000 4 0.5 ml T7 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 54 �Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina • En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo de SB excepto de las columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2). • En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la batería de tubos de ensayo, según protocolo de la tabla 1. • Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se realiza mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl / pocillo de la fila B y pasar a la fila. • Volver a homogenizar. Recoger 25 µl / pocillo de la fila C y pasar a la D. Homogeneizar y recoger 25 µl / pocillo y descartar. • De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H. • Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 550 µl 50 µl 50 µl de T1 de T1 de T1 de T2 de T2 de T3 de T3 de T4 de T4 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 10 11 12 E F G H 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T5 de T5 de T6 de T7 de T8 de T9 de T10 de T11 de T12 de T13 de T14 de T15 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS SB 55 �Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/50 1/50 1/100 1/100 1/150 1/150 1/200 1/200 B 1/100 1/100 1/100 1/200 1/200 1/300 1/300 1/400 1/400 C 1/200 1/200 1/200 1/400 1/400 1/600 1/600 1/800 1/800 D 1/400 1/400 1/400 1/800 1/800 1/1200 1/1200 1/1600 1/1600 F 1/250 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/3000 1/4000 1/5000 1/6000 1/7000 1/8000 1/9000 G 1/500 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/6000 1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000 H 1/1000 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000 E Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos Se prepara una suspensión de GR al 2 % según lo indicado anteriormente. En este ensayo se prepara una suspensión de 5 ml. 1. Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca. 2. Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos a bajas revoluciones. Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión con los anticuerpos presentes en las diluciones de hemolisina). 3. Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se dispensan adicionalmente otros 25 µl (esta columna actúa como control del poder hemolítico de la hemolisina). Preparación y dispensado de una solución de complemento El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que siempre haya reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) Ac (hemolisina diluida). Para complementos (comerciales) que den un título (unidad de complemento) superior a 1/90, debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que den títulos inferiores, la solución que se deberá preparar será de 1/10 - 1/20 (tabla 4). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 56 �Tabla 4: Dilución del complemento TV Complemento Solución de complemento 1/20 5,7 ml 0,3 ml Solución de complemento 1/30 5,8 ml 0,2 ml 1. Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C, D, F, G y H, excepto en los pocillos de la columna 1. 2. Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Incubación Incubar a 37 ± 2 ° C, durante 30 minutos. Cálculos y expresión de resultados El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consigna mediante un sistema de cruces (tabla 5). Tabla 5: Expresión de resultados ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente. Cálculos de los resultados • Se define la unidad de hemólisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. • Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de hemólisis presentan un grado de hemólisis similar. • Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor concentración de hemolisina). • La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir 2 UH 100 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 57 �Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000 DT= 2 x 1/1000= 1/500 • Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas de trabajo. • Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5 º C para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote, fecha y cantidad de hemolisina diluida. IV: Sistema hemolítico • Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema depende del número de placas que se deberán utilizar (1 placa= 96 pocillos fondo en U). Ejemplo para dos placas: 2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de perdidas) • Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2 % y luego 2,5 ml de hemolisina al título de uso agitando suavemente para homogenizar las dos suspensiones e incubar a 37 ± 2° C, durante 15 minutos. V: Titulación complemento Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema enzimático denominado ‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de fijación del complemento es la de detectar uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean glóbulos rojos, es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la reacción de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el papel de antígeno y el suero de conejo (hemolisina) de anticuerpos. El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo llevar a temperatura de laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacará de la heladera en el momento de su utilización. Si se prevé que se va a utilizar más de un vial, se juntarán todos en uno y se titulará el conjunto. Preparación de las soluciones “madres” del complemento 1. Realizar 6 diluciones “madres’’ del complemento, empleando para ello tubos de ensayo. Tabla 1 de este anexo. 2. En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se homogeneiza perfectamente mediante un agitador. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 58 �Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 SB µl 725 850 975 1100 1225 1350 C µl 25 25 25 25 25 25 Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB 1. En la filas B, C y D de una placa fondo en U, dispense 25 µl/pocillo de SB (tabla 2). 2. En la filas A de la placa, dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de complemento por duplicado según protocolo descripto en tabla 1. 3. Con una pipeta multicanal, recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a la fila B. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se propiciará mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensación de la pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila. 4. Vuelva a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogenice y recoja 25 µl/pocillo y descártelos (las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3). 5. Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa. 6. Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB E F G H MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 59 �Tabla 3. Diluciones finales del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 B 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 C 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 D 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 E F G H Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 15 minutos. Dispensado del sistema hemolítico El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto anteriormente. 1. Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl / pocillo del SH en todos los pocillos de la placa. 2. Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. 3. Incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 60 �Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces: Tabla 4 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de complemento (UC) o unidad hemolítica como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UC con la dilución más alta que de 100 % de hemólisis. 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC. Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el análisis de 2 placas según el procedimiento descripto. Ello supone un volumen total de solución de complemento de 2 placas x 2,4ml / placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de pérdidas). a. Supongamos que UC = 1/100 DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50 Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro: En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml b. Por tanto las proporciones serán: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml de SB. Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 61 �Control de dos unidades de complemento (2 UC) Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizarán diluciones del complemento que contengan 2 unidades; 1,5 unidades; 1 unidad; 0,75 unidades y 0,5 unidades. Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia (tabla 5). Tabla 5. Diluciones del complemento Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 Se dispensarán por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en los correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de SB (tabla 6). Tabla 6. Unidades del complemento en la placa 1 2 3 4 5 A 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U B 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U 6 7 8 9 10 11 12 C D E F G H 1. Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2-4 minutos e incube en estufa a 37 ± 2 ° C durante 15 minutos. 2. Luego repita lo descripto agregando el SH Lectura del análisis: • Pocillo con 2 unidades: 100 % de hemólisis • Pocillo con 1,5 unidades: 100 % de hemólisis MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 62 �• Pocillo con 1 unidades: 100 % de hemólisis o traza de GR en suspensión • Pocillo con 0,75 unidades: 0 % a 75 % de hemólisis • Pocillo con 0,5 unidades: 0 % a 50 % de hemólisis Control de calidad El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un grado de reacción similar. En caso contrario se repetirá el análisis. Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el 100 % (N) de hemólisis (las más bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de hemólisis (las más alta). En caso contrario se repetirá el análisis. En el control de 2 unidades de complemento deben dar los resultados preestablecidos. El análisis debe informarse como APROBADO / NO APROBADO en el apartado de observaciones de la planilla de titulación del complemento. En caso de no aprobado, se repite el proceso. VI: Titulación antígeno Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 %. Se trata de determinar lo que se denomina UA (unidad antigénica) que corresponde para cada lote de antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los sueros problema, en la cantidad suficiente para fijar el complemento. El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros problema y que serán capaces de fijar el complemento. Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento. Preparación de diluciones “madre” de antígeno Se preparan tres diluciones previas en tubos, luego se dispensarán: • en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un tercer tubo 1250 µl de SB y 10 µl de antígeno. Esto da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125, respectivamente. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 63 �Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno En una placa de fondo en U se dispensan 25 µl de SB en todos los pocillos salvo en la columna 1 y los pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizarán hasta la columna 9 (tabla 1). En la columna 1 se pondrán 50 µl de las soluciones madres del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de forma simple (tabla 1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la columna 1 a la columna 9 y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10, H11 y H12. Es decir, se pasan 25 µl de la columna 1 a la 2, se homogeniza y se pasan otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente, y se eliminan los 25 µl que sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12. Tabla 1. Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno 1 2 3 4 5 6 7 A 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 B 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 8 9 10 11 12 1/6400 1/12800 1/50 1/75 1/125 1/6400 1/12800 1/100 1/150 1/250 1/200 1/300 1/500 C D 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/400 1/600 1/1000 E 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/800 1/1200 1/2000 1/1600 1/2400 1/4000 1/8000 F G H 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/3200 1/4800 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/6400 1/9600 1/16000 Dispensado de sueros controles positivo y negativo Seguidamente se dispensan 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la fila A, B, D, E, G y H salvo en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl de suero control negativo y servirá como control de hemolisis. El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en la reacción de fijación del complemento. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 64 �Dispensado de una solución de complemento Posteriormente se dispensan 25 µl de complemento a todos los pocillos según el título obtenido previamente. Se agita la placa 2-4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37 ± 2°C. Dispensado del sistema hemolítico Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos. Luego se agita la placa 2-4 minutos e incubará durante otros 30 minutos a 37 ± 2°C. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces. Tabla 2 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un depósito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un depósito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un depósito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 65 �Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación completa (0 % de hemolisis). 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de antígeno presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor concentración de antígeno). 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA. Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800: DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 66 �Anexo I Modelo de planilla de emisión de resultados MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 67 �Bibliografía MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 68 �Normativa vigente Ley 24.696 de año. Por la cual se declara de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio Nacional. 26 de septiembre de 1996. B.O. N.º 28.492. Norma Organización Internacional de Normalización [ISO/IEC 17025]. 2017 (España). Resolución 957 de 2024 [Senasa]. Por la cual se aprueba el uso de los inmunógenos RB51 y Delta PGM. 15 de agosto de 2024. Resolución 276 de 2023 [Senasa]. Por la cual se adopta el sistema de diagnóstico serológico para el Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la República Argentina. 14 de abril de 2023. Resolución 77 de 2021 [Senasa]. Por la cual se sustituye el articulo 9° y 10 de la Resolución N.° 67/19 y otras modificaciones. 19 de febrero de 2021. Resolución 67 de 2019 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional De Control y Erradicación De Brucelosis Bovina en la República Argentina, de aplicación obligatoria en todo el territorio nacional, excepto en la provincia de Tierra Del Fuego, Antártida e islas del Atlántico Sur. 1.° de febrero de 2019. Resolución 857-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se declara como zona libre de brucelosis ovina y caprina a Brucella melitensis, a la región patagónica y se establece el Programa De Vigilancia y Prevención. 27 de diciembre de 2017. Resolución 372-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional de Control de Brucelosis Caprina en la República Argentina y se establecen las estrategias sanitarias básicas que deben ser aplicadas en cada zona o provincia. 14 de junio de 2017. Resolución 98 de 2016 [Senasa]. Por la cual se resuelve la comercialización de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis.18 de marzo de 2016. Resolución 63 de 2013 [Senasa]. Por la cual se crea el Registro Nacional de Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina. 28 de febrero de 2013. Resolución 246 de 2007 [Senasa]. Por la cual se aprueban los requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se dediquen a la elaboración de productos destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis Animal y la Tuberculosis Animal. 04 de mayo de 2007. Resolución 438 de 2006 [Senasa]. Por la cual de adopta el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. 4 de agosto de 2006. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 69 �Resolución 736 de 2006 [Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos]. Por la cual se crea la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. 17 de noviembre de 2006. Resolución 79 de 2003 [Senasa]. Por la cual se aprueba el procedimiento para la supervisión de la aplicación de los tratamientos de fumigación oficial. 26 de enero de 2003. Resolución 1484 de 1993 [Senasa]. Por la cual se establecen las normas para la elaboración, fraccionamiento, distribución, expendedor para los reactivos destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal. 28 de diciembre de 1993. Bibliografía consultada Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D. and Verger, J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. INRA, Paris. Angus, R.D. & Barton, C.E. (1984). The production and evaluation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand. (56,349-356). Centro Panamericano de Zoonosis (1968). Técnicas e interpretación de sero-aglutinación para el diagnóstico de la brucelosis bovina. Nota Técnica Nº2. Ramos Mejía. Ciocchini A.E., Rey Serantes D. A., Melli L.J., Iwashkiw J.A., Elena S., Franco C., Nicola A.M., Feldman M.F., Comerci D.J., Ugalde J.E. (2014) A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigenic target for diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol. 172 (3-4):455-65. Cortina M.E., Balzano R.E., Rey Serantes D.A., Caillava A.J., Elena S., Ferreira A.C., Nicola A.M., Ugalde J.E., Comerci D.J., Ciocchini A.E (2016). A bacterial glycoengineered antigen for improved serodiagnosis of porcine brucellosis. Journal of Clinical Microbiology. 54(6), 1448-1455. Gall D., Nielsen K., Forbes L., Cook W., Leclair D., Balsevicius S., Kelly L.,Smith P. & Mallory M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37,110-118. Gall D.,Nielsen K.,Forbes L.,Davis D.,Elzer P.,Olsen S.,Balsevicius S.,Kelly L., Smith P., Tan S. & Joly D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J. Wildl. Dis., 36, 469-476. Bagnat, Moras, Vibot, Samartino, T. De Echaide, Walsh, Diprodesa, Di Lorenzo, Nicola (2006). Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis. Macmillan A.P., Greiser-Wilke I., Moennig V. & Mathias L.A. (1990). A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. DtschTierarztl. Wochenschr. (97, 83-85). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 70 �Lucero, N., Escobar, G., Ayala, S., Hasan, D. (2008). Manual de Procedimientos Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana. Servicio de Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”, Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur, Buenos Aires. Nielsen K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol. (90,447-459). Nielsen K., Gall D., Jolley M., Leishman G., Balsevicius S., Smith P., Nicoletti P. & Thomas F. (1996). A homogenous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus. J. Immunol. Methods (195,161-168). Nielsen K., Kelly L., Gall D., Balsevicius S., Bosse J., Nicoletti P. & Kelly W. (1996). Comparison of enzymeimmunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet. Med. (26, 17–32). Nielsen K., Kelly L., Gall D., Nicoletti P. & Kelly W. (1995). Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet.Immunol.Immunopathol. (46,285-291). Organización Mundial de la Salud (2009). Manual técnico de referencia para la higiene de las manos. Senasa (2019). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires. Senasa (2009). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires. Senasa (1998). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires. Silva Paulo, P.; Vigliocco, A.M., Ramondino, R., Marticorena, D., Bici, E., Briones, G., Gorchs, C., Gall, D., Nielsen, K. (2000). Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol. (7, 828-831). Stack J.A., Perrett L.L., Brew S.D., Macmillan A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples. Vet. Record (145, 735-736). Szyfres, B. (1983). El Diagnóstico de la brucelosis bovina en el contexto de un programa de lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA. Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone, A., Marchesino, M., Nielsen, K. (1998). Evaluation of an Indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet. Med. (36, 211-217). Vanzini, V., Echaide, S., (1998). Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar anticuerpos anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos obtenidos en la EEA Rafaela. World Health Organization (2005). Laboratory Biosafety Manual. Second Edition. Geneva. World Health Organization (1986). Joint Food And Agriculture Organization Of The United Nations/World Health Organization Expert Committee On Brucellosis. Technical Report Series 740, Sixth Report. Geneva. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 71 �World Organisation for Animal Health (2022). Manual of standards for diagnostic test & vaccines. Brucellosis (infection with Brucella abortus, B. melitensis and B. suis). Wright P.F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev.sci.tech., (12, 435-450). Wright P.F., Tounkara K., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1997). International reference Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech. (3, 824-832). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 72 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de procedimiento. Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0177 Abstract A summary of the resource. El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Técnicas reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Incluye nociones sobre medidas de bioseguridad y controles de calidad a aplicarse en los procedimientos técnicos de laboratorio. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivos Abreviaturas y definiciones Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Principios de bioseguridad Prácticas operativas seguras y hábitos personales Limpieza y desinfección del laboratorio Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Control de calidad de insumos Equipos Sobre la enfermedad Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino Infección por Brucella en ovejas y cabras Infección por Brucella en cerdos Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo Ejecución del ensayo de BPAT Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Desarrollo Ejecución del ensayo Incubación Lectura e interpretación de resultados Informes de resultados Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos Desarrollo Toma de la muestra Ejecución del ensayo Lectura Modificación de la prueba para tanques muy grandes Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Etapas Desarrollo ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero Desarrollo Ejecución del ensayo Lectura e interpretación Fijación de complemento Desarrollo Manejo y conservación de las muestras Condiciones del ensayo Ejecución Lectura de resultados Anexos Bibliografía Brucelosis Laboratorios https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/6d84c06ae5409c4a495293f828feb85b.pdf 2d61642ea18442889d11f4e7d7874abb PDF Text Text Solicitud de vacunas RB51 y Delta-PGM contra brucelosis bovina y carga de acta Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Programa de Brucelosis bovina Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 4 Solicitud de uso 4 Autorización de solicitud de uso de la vacuna brucelosis RB51 y 9 Delta-PGM Consulta del veterinario acreditado 12 Motivos de rechazo de la solicitud de vacuna 15 Carga del acta de vacunación estratégica 16 Contacto 23 �Introducción La vacunación estratégica del Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina —dispuesta por la Resolución Senasa N.° 957/24 y su modificatoria N.° 936/2025— contempla el uso de vacunas RB51 o DELTA-PGM, aplicables a vacas adultas de establecimientos con casos de brucelosis. El presente instructivo tiene como propósito disponer de una herramienta que guíe al veterinario acreditado en brucelosis bovina para gestionar la solicitud de uso y registro de inoculación con estas cepas. La aplicación de esta vacuna es de carácter voluntario y, en caso de que el profesional acreditado lo indique, el establecimiento deberá reunir las siguientes condiciones: • Los animales deben estar previamente vacunados con cepa 19 y las actas tendrán que estar cargadas en el Sistema Integrado de Gestión de Sanidad Animal (SIGSA). • El Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (Renspa) debe tener estatus asignado: libre, negativo o caso. • La UP que posea antecedente de “Caso” debe contar con una serología no mayor a 6 meses de antigüedad, previamente registrada en el SIGSA. • La existencia de vacas de la UP debe ser mayor o igual a la cantidad de dosis solicitada. Solicitud de uso Si el establecimiento reúne las condiciones, el veterinario acreditado deberá cargar una solicitud de uso para habilitar la compra de la misma y poder hacer uso de la vacuna luego de su aprobación. Para cargar la solicitud, el veterinario acreditado debe ingresar a través del sitio web de la Agencia de Recaudación y Control Aduanero (ARCA) ingresando con su número de CUIT y clave fiscal. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 4 �Allí, en el apartado de “Mis Servicios” podrá acceder al botón SIGSA. El sistema lo redirigirá al sitio web del SIGSA, donde deberá seleccionar como perfil de uso la opción de Veterinario Acreditado Brucelosis. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 5 �Al ingresar al SIGSA como Veterinario Acreditado Brucelosis, verificar que se encuentra en vista bovinos y dirigirse a: Sanitario – Brucelosis – Nueva Solicitud Vacunas. Luego, se desglosa un listado en el cual se deberá seleccionar la opción “Nueva Solicitud de Vacunas”. Posteriormente, se requerirá completar el campo de Unidad Productiva con el número de Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (Renspa) del establecimiento que se deberá vacunar. Luego, hacer click en el botón “Registrar”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 6 �A continuación, se abrirá una nueva pantalla con el título “Listado de Unidades Productivas”. Allí, se tendrá que cargar nuevamente el número de Renspa en el campo donde lo solicita. Luego, indicar la opción “Buscar”. En la siguiente pantalla, se deberá seleccionar al establecimiento involucrado. Posteriormente, aparecerá una nueva pantalla titulada “Nueva Solicitud de Vacunas Brucelosis”, donde aparecerá el Renspa indicado. Allí se deberá completar el campo de “Veterinario Responsable” haciendo click en “Buscar” e indicando el nombre del veterinario en cuestión. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 7 �Debajo de la búsqueda, podrá observar el nombre del veterinario acreditado con su número de CUIT. Si los datos son correctos, indicar la opción “Seleccionar”. Luego, el sistema redirigirá a la pantalla de “Nueva Solicitud de Vacunas Brucelosis”, donde se observarán los datos de la Unidad Productiva, Titular, Establecimiento, Veterinario Responsable. En esta oportunidad, se tendrá que agregar la cantidad de dosis de vacuna requerida (considerando que es un requisito fundamental que coincida con el número de bovinos para vacunar). Luego de corroborar los datos, hacer clic en “Registrar”. Es importante tener en cuenta previamente el stock de vacas del establecimiento antes de realizar la acción sanitaria. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 8 �En la siguiente pantalla se observará que la solicitud emitida se encuentra en estado “Pendiente”. Para finalizar el proceso, el productor o titular del Renspa deberá aceptar o rechazar la solicitud. Autorización de solicitud de uso de la vacuna brucelosis RB51 y Delta-PGM Para autorizar la solicitud, el titular de la unidad productiva (UP) deberá acceder al sitio web de ARCA con su CUIT y clave fiscal, dirigirse a “Mis Servicios” y, posteriormente, ingresar al SIGSA. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 9 �Al ingresar al SIGSA como productor agropecuario, dirigirse a la ventana “Sanitario”, acceder a la opción “Brucelosis” e ingresar “Consultar solicitudes de vacunas”. Al ingresar, se deberá indicar el Renspa para el cual se hizo la solicitud y hacer click en “Buscar”. Posteriormente, se desplegará el siguiente listado que contempla las solicitudes realizadas para ese Renspa. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 10 �Allí podrá observar el número de solicitud, el Renspa, quién fue el veterinario solicitante, la cantidad de dosis solicitadas, el estado Pendiente, la fecha de la solicitud y la pestaña de Acciones. En esta última pantalla se deberá acceder en el ícono para visualizar el detalle de la solicitud pendiente. Al acceder al detalle, la siguiente pantalla brinda los datos: número de solicitud, fecha de solicitud, datos completos de la UP, nombre del veterinario y cantidad de dosis solicitadas. Al describir el estado como Pendiente, el productor deberá autorizar o rechazar la solicitud. Al autorizar la solicitud, el sistema realiza el cambio de “Pendiente” a “Autorizado por el productor” y permite emitir la Constancia de uso de vacunación estratégica de brucelosis, la cual autoriza a la compra de las dosis de vacuna y tiene una fecha de límite de uso para ser utilizada. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 11 �La autorización de uso de las vacunas tiene una fecha de vencimiento de 60 días luego de la fecha de solicitud. Consulta del veterinario acreditado Luego de la autorización realizada por el productor o titular del Renspa, el veterinario acreditado podrá consultar el estado de su solicitud. Para ello, deberá acceder al SIGSA, ingresar a la ventana “Sanitario”, luego a “Brucelosis +” y seleccionar “Consultar Solicitudes Vacunas”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 12 �Allí deberá indicar el número de Renspa del establecimiento involucrado en la gestión y hacer clic en “Buscar”. Luego, se podrá visualizar el listado de solicitudes de vacunas de brucelosis generadas por el veterinario acreditado al Renspa seleccionado. El productor deberá autorizar aquellas solicitudes que continúen en estado “Pendiente”. Las que figuren como “Autorizada por el Productor” ya se encuentran listas para obtener la Constancia. A través del ícono del panel “Acciones”, se abrirá la siguiente pestaña: INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 13 �En la opción “Constancia”, el usuario podrá generar el documento e imprimirlo. Con este certificado de uso puede dirigirse a cualquier centro distribuidor de la vacuna para realizar la compra, la cual será solicitada por el vendedor. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 14 �Motivos de rechazo de la solicitud de vacuna Al momento de ingresar el Renspa de una UP en una nueva solicitud, se deberá colocar el nombre del veterinario responsable y la cantidad de dosis requeridas. Luego, el solicitante deberá hacer clic en “Registrar”. Si el sistema rechaza la solicitud, significa que la UP no cumple con la totalidad de las condiciones que debe reunir para su aprobación: • Que el establecimiento se encuentre sin estatus sanitario. • Que no se encuentre registrada una serología en los últimos 6 meses en establecimientos con estatus de “Caso”. • Que no tenga registro de la vacunación de cepa 19. • Que no cuente con stock de vacas. El sistema le informará al solicitante cuál es la condición o condiciones que no cumple. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 15 �Si la cantidad de dosis supera el stock de vacas declaradas en el SIGSA, se rechazará la solicitud. Las vacunas solicitadas por el acreditado deben ser igual o menor a la cantidad de vacas. Carga del acta de vacunación estratégica Una vez realizada la vacunación estratégica se deberá cargar un acta de vacunación para registrar el uso. El veterinario acreditado en brucelosis debe ingresar en el SIGSA y seleccionar el perfil de usuario “Veterinario Acreditado Brucelosis”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 16 �Luego, el usuario deberá desplegar la ventana “Sanitario”, ingresar en “Brucelosis +” y hacer clic en “Nueva Acta”. Allí se tendrá que cargar el número de Renspa de la UP. Si los datos que arroja el sistema son correctos, ingresar la opción “Seleccionar”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 17 �En la siguiente ventana, se podrán visualizar dos opciones en la columna “Acciones”: una contempla el listado del stock del establecimiento y la otra, a través del ícono , permite abrir una pestaña para la carga de actas de vacunación. Al ingresar, se despliega la ventana “Nueva acta de Brucelosis”. Allí es importante completar todos los datos correspondientes a la vacunación. Al tratarse de un acta de vacunación estratégica, en la opción “Estratégica RB51/DELTA PGM” se deberá cambiar la palabra “NO” e indicar “SI”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 18 �La modificación genera que la categoría por vacunar cambie de ternera a vaca. Desde este momento, se visualizará el stock de vacas de la UP y se podrá continuar con la carga de todos los campos. En la opción “Vacunador” se deberá hacer clic en el botón “Buscar” para que el sistema arroje el nombre y los datos del veterinario acreditado. En la siguiente ventana se indicará el número de CUIT correspondiente al vacunador y, posteriormente, se desplegará la lista de roles. Allí se deberá dirigir al panel de “Acciones” y seleccionar en el ícono de la opción “Acreditado Veterinario Brucelosis”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 19 �Luego, el acreditado deberá continuar con la cantidad de dosis utilizadas, la fecha de la vacunación y un número de acta a elección. En el ítem “Vacuna” se deberá seleccionar el botón “Buscar”. Posteriormente, se abrirá una pestaña para observar el listado de las vacunas e indicar la marca utilizada. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 20 �Luego de agregar la marca de la vacuna aplicada, se deberá agregar el número de serie y seleccionar el botón “Guardar”. . Para consultar el acta, se deberá ingresar nuevamente al SIGSA, pero con el perfil de “Productor agropecuario”. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 21 �Al ingresar al sistema, se deberá dirigir a la ventana “Sanitario”, ingresar en “Brucelosis +” y seleccionar “Consultar actas”. Luego, se deberá indicar el número de Renspa y seleccionar el botón de “Buscar”. Allí se podrán visualizar las actas de vacunación. INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 22 �En el panel de “Acciones”, al hacer clic en el ícono registrada. se observará el acta Contacto Programa de Brucelosis bovina Correo electrónico: brucelosisbovina@senasa.gob.ar INSTRUCTIVO. SOLICITUD DE VACUNAS RB51 Y DELTA-PGM CONTRA BRUCELOSIS BOVINA Y CARGA DE ACTA 23 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Solicitud de vacunas RB51 y Delta-PGM contra brucelosis bovina y carga de acta Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa de Brucelosis bovina Dirección Nacional de Sanidad Animal Coordinación General de Comunicación Institucional Relation A related resource Resolución Senasa 957/24 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0170 Abstract A summary of the resource. El presente instructivo tiene como propósito disponer de una herramienta que guíe al veterinario acreditado en brucelosis bovina en la solicitud de uso y registro de vacunas RB51 o DELTA-PGM para ser aplicadas en vacas adultas pertenecientes a establecimientos con casos de brucelosis. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Indice Introducción Solicitud de uso Autorización de solicitud de uso de la vacuna brucelosis RB51 y Delta-PGM Consulta del veterinario acreditado Motivos de rechazo de la solicitud de vacuna Carga del acta de vacunación estratégica Contacto Brucelosis SISTEMAS INFORMATICOS Veterinarios https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/171320ae3fd098c7f3a9be4124bab5a3.pdf b7bee07ed84f1d586b1873d82a860fe8 PDF Text Text BRUCELOSIS (B. abortus, B. melitensis, B. suis) 2019 Laboratorio de Referencia OIE/FAO para Brucelosis Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico �Brucelosis MANUAL DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Versión 4.0/2019 Elaborado por: Departamento Brucelosis (Laboratorio de Referencia para OIE/FAO) Ana M. Nicola, M.V., MSc. Sebastián Elena, M.V., MSc. Cristina Franco, Vet., MSc. Aprobado por: Bernardo Alonso, M.V. Coordinación Bacteriología Eduardo Maradei, M.V. Dirección Laboratorio Animal Carlos Zenobi, M.V., MSc. Dirección General de Laboratorios y Control Técnico �OBJETIVO El presente Manual tiene como objetivos: ▪ Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los Laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la Brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Red de Laboratorios de SENASA. ▪ Proporcionar a la Red de Laboratorios de SENASA un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. ▪ Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse, cuando se desarrolle un procedimiento técnico. ▪ Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Las técnicas diagnósticas descriptas en el presente Manual son las internacionalmente reconocidas y recomendadas por la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) y EL SENASA. Página 2 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �INDICE Definiciones y Abreviaturas 4 Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad en el Laboratorio 5 Introducción Brucelosis 9 Procedimientos de Trabajo (ingreso/rechazo de muestras) 14 Prueba de screening con antígenos tamponados en placa (BPAT y RBT) 17 Prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT y 2-ME) 20 Prueba de anillo en leche 26 ELISA Indirecto 29 ELISA por competición / bloqueo 32 Ensayo de Polarización Fluorescente 35 Fijación de complemento 38 Normativa vigente 57 Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis 58 Anexo I Lavado y desinfección de manos 60 Anexo II Modelo de Planilla de emisión de resultados 62 Bibliografía 64 Página 3 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �DEFINICIONES / ABREVIATURAS � Ag: Antígeno � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � Biovariedad: bv BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en placa CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo C’: Complemento de cobayo DILAB: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico DLA: Dirección de Laboratorio Animal DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal DT: Dilución de Trabajo ELISA: Enzimoinmunoensayo FCT: Fijación de Complemento test FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente GR: Glóbulos Rojos IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto IgG: Inmunoglobulina G IgM: Inmunoglobulina M LPS: Lipopolisacárido 2-ME: 2- Mercaptoethanol M: Molar mP: milipolarización MRT (PAL): Prueba de anillo en leche OIE: Organización Mundial de Sanidad Animal PAC: Poder anticomplementario RBT: Rosa de Bengala Test RENSPA: Registro Nacional Productor Agropecuario SAT: Seroaglutinación lenta en tubo SENASA: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria SH: Sistema Hemolítico UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro UA: Unidad de Antigeno UC: Unidad de Complemento UH: Unidad de Hemolisina Página 4 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �MEDIDAS GENERALES LABORATORIO DE BIOSEGURIDAD Y SEGURIDAD EN EL Se entiende por Bioseguridad: "La disciplina que trata el manejo seguro y la contención de microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos". La práctica del manejo seguro de microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación de los principios de contención y la evaluación de riesgos. Principios de Bioseguridad: El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos. La contención primaria, la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de Equipos de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de vacunas al personal cuando corresponda, puede brindar un mayor nivel de protección del personal. La contención secundaria, la protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos, se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Prácticas y Técnicas de Laboratorio. El elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas estándares. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del personal. Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien informado acerca de las técnicas de laboratorio adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo. Cuando las prácticas de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento. Prácticas operativas seguras y hábitos personales ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ El acceso al laboratorio debe ser limitado o restringido. El laboratorio debe ser diseñado para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos. Los muebles de laboratorio deben tener la capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza. Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos. La iluminación debe ser adecuada para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que puedan molestar la visión. Si el laboratorio tiene ventanas que se abren hacia el exterior, deben estar provistas de mosquiteros. Se debe usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Se debe retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas), se debe usar además, calzado cerrado y cabello recogido. Página 5 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Se debe usar guantes cuando es probable que las manos entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados. Puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes. Se deben descartar los guantes cuando están contaminados, y se retiran cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o, cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar fuera del laboratorio. No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo. Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial. Las personas deben lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I). Los alimentos se almacenan fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados con este único fin. Está prohibido pipetear con la boca; se debe utilizar dispositivos de pipeteo mecánicos. Se debe aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes. Todos los procedimientos se llevan a cabo con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles. Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por día, luego de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable. Todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados se descontaminan antes de ser desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos. Hojas de seguridad: (en inglés, Material Safety Data Sheet o MSDS) es un documento que indica las particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado. El principal objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. Esta hoja o ficha contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales. El laboratorio debe tener las hojas de cada sustancia química que utiliza en el Laboratorio impresas y capacitar al personal sobre las mismas. Limpieza y desinfección del Laboratorio Todo Laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos a fin de disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del laboratorio y volumen de trabajo. La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas, etc. Dentro de la limpieza de los laboratorios se debe incluir control de insectos y roedores. Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) El Laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los residuos peligrosos. Los residuos peligrosos pueden causar daño, directa o indirectamente, a seres vivos o contaminar el suelo, el agua, la atmósfera o el ambiente en general. Se consideran residuos patológicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a determinadas dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la salud, luego de estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía. Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en el lugar de generación de los mismos. Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: Incineración, enterramiento por relleno de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a ese fin. Se ajustará a la normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio. Página 6 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (Buenas Prácticas de Laboratorio), requisitos particulares de SENASA y la Norma ISO/IEC 17025 (última versión vigente) según la categoría del Laboratorio. Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados. Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser detectados para poder aplicar acciones correctivas y /o preventivas. Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos, con la utilización diaria de sueros controles internos con títulos conocidos y, el control externo que se refiere al realizado por un laboratorio de referencia. Este último se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad internos implementados y la realización de inter laboratorios. El control permanente de la calidad de los resultados junto a las buenas prácticas de laboratorio que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantizan el resultado confiable del diagnóstico. Control de calidad de insumos Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben estar establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo. La composición, tipo de envase, identificación y lugar de almacenamiento debe ser la indicada en los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio. Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas. Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo, deben utilizarse de acuerdo a las especificaciones del Manual de Procedimientos Operativos, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación. Los reactivos para el diagnóstico de Brucelosis que se comercializan en la República Argentina, deben cumplir la normativa vigente de SENASA y aprobar el control de calidad de cada lote o serie indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de antígeno/kit que se utiliza con la fecha de uso. En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o pureza se encuentran establecidos en base a diferentes normas o criterios, dependiendo de las instituciones u organismos internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran la American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes niveles de pureza del agua en función de los parámetros físicos químicos, tales como conductividad eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice. Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica. Especificaciones según ISO 3696 Página 7 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �CLASIFICACION DE LOS TIPOS DE AGUA SEGÚN NC- ISO 3696: 2004 Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más exigentes, incluyendo la cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de una membrana con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice fundido). Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para análisis delicados, incluyendo la espectrometría de absorción atómica (EAA) y la determinación de componentes en cantidades mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u osmosis inversa seguida de destilación. Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la preparación de soluciones de reactivos. Se puede preparar mediante una sola destilación, por desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo normal de análisis. Equipos El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el laboratorio. Página 8 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �INTRODUCCIÓN: BRUCELOSIS (Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad Animal -OIE)- versión 2016. http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/3.01.04_BRUCELL.pdf Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones, humanas o animales, causadas por distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis) del Manual de la OIE. Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis) El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden Rhizobiales, en la clase Alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la re aprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos relacionadas con las seis especies de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el reservorio natural de las mismas. Aunque solo se han descrito dos cepas de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado como nuevas especies de Brucella. Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción del microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos Página 9 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo se encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos machos adultos pueden presentar orquitis / epididimitis y la brucelosis puede ser una causa de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por Brucella. Infección por Brucella en ovejas y cabras La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causada principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva Zelanda. Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales de transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988). Infección por Brucella en cerdos La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B. suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis, pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis porcina puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de jabalíes. En general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la copula también es frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días 50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infectados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones, cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6 meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al., 2012). La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en jabalíes parece ser Página 10 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares, sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres. Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos. Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio, o salvajes en libertad. Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis. Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano y el europeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el ganado bovino, ovino y caprino. La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje), se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos antropogénicos. Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son el hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por co-habitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y los caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microrganismos similares a B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado que son distintas de B. suis en base al perfil genético. Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos, de tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor; a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden tener lugar en casi cualquier lugar, a veces en el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos signos locales, como aborto, Página 11 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno, especialmente la médula ósea. Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad La infección por Brucella es fácilmente transmisible al ser humano, en el que causa un proceso febril (fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones graves que afecten a los sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central. Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos constituye el principal riesgo para el público general en los lugares en los que la enfermedad es endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del riesgo biológico Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS, 1953; OMS, 2004). Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Pruebas serológicas No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos. Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se describen en esté manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin embargo, los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico. Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FCT) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como el Enzimoinmunoensayo (ELISA) y el Ensayo de Polarización Fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada. En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado. Página 12 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 1. Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus, melitensis o suis. (Manual OIE 2016) Propósito Método Demostrar ausencia de infección en la población Demostrar ausencia de infección en animales individualesa Contribuir a las políticas de erradicaciónb Confirmar casos clínicos sospechososc Determinar la prevalencia de la infección – vigilancia en el rebaño / manada Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones tras la vacunación Identificación del agente Métodos de tinción - - - + - n/a Cultivo - - - +++ - n/a - - - +/++ - n/a d PCR Detección de la respuesta inmune BBAT (RBT o BPAT) +++ ++ +++ + +++ n/a FPA ++ ++ + ++ ++ n/a CFT ++ ++ +++ ++ +++ n/a I-ELISA +++ ++ +++ ++ +++ n/a C-ELISA ++ + + + ++ n/a BST ++ - + +++ ++ n/a SAT ++ + + - + n/a Pruebas basadas en el NH y proteínas del citosole - - + ++ - n/a Prueba en leche de tanquef IELISA en leche o prueba de anillo en leche +++ - +++ + +++ n/a Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad u otros factores limitan su aplicación; - = no adecuado para esta finalidad; n/a = no aplicable. PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de bengala] y BPAT [prueba de aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA =enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina; SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo a Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por Brucella. bp Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/manadas, se recomienda combinar pruebas para aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o IELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST. c En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal. En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso en ausencia de signos clínicos. En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o BST. En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST. d Es posible que se obtenga falsos positivos. e En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev. 1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección. f Solo ganado lechero. Página 13 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PROCEDIMIENTOS DE TRABAJO PARA EL DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS EN EL LABORATORIO DE RED REGISTRO DE ENTRADA DE MUESTRAS Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y rechazo de muestras. Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta identificación, embalaje y documentación que acompaña a las mismas. Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con backup), en el que figure como mínimo la siguiente información: ▪ Fecha de recepción de muestras. ▪ Cantidad de muestras. ▪ Especie. ▪ Fecha de extracción de muestras. ▪ Procedencia: establecimiento, número de RENSPA. ▪ Localidad: Departamento, Partido, Provincia. ▪ Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), SENASA. ▪ Motivo del envío: • DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), • MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica Para Mantenimiento del Estatus), • SAN (Saneamiento de Rodeo Bajo Plan), CSM (Certificado de Seronegatividad para el Movimiento), • Control Interno (Según Requerimiento de Veterinario Acreditado), • Re-muestreo, otros. CARACTERISTICAS Y CONDICIONES DE LAS MUESTRAS Condiciones de "recepción" de las muestras: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Sangre entera o suero refrigerados. Suero congelado. Leche para PAL refrigerada (No congelada) Leche para IELISA refrigerada/congelada Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo. Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución SENASA 67/2019). Condiciones de "rechazo" o demora del procesamiento de las muestras: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II, Resolución SENASA 67/2019). Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la toma de muestra. Sangre entera congelada. Leche para PAL congelada, contaminada. Sangre entera o suero, contaminados. Sueros hemolizados. Tubos no identificados. Volumen insuficiente. Página 14 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Los Laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras. Informes de resultados Los informes que elabore el Laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar adecuadamente las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo II del presente Manual). En el informe de resultados debe constar: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Logo del Laboratorio/Dirección/Tel/email/ Nº de L N° de Protocolo interno. Fecha de extracción de muestras. Fecha de recepción de muestras. Fecha de informe o emisión de resultados. Cantidad de muestras. Especie. Procedencia: establecimiento, número de RENSPA. Localidad: departamento, partido, provincia. Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), SENASA. Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica Para Mantenimiento del Estatus), SAN (Saneamiento de Rodeo Bajo Plan), CSM (Certificado de Seronegatividad para el Movimiento), Control Interno (Según Requerimiento de Veterinario Acreditado), Remuestreo. Columnas con la información del tubo/caravanas/edad/fecha de vacunación/pruebas utilizadas/Resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME, ELISA, FCT, FPA), valor de corte e interpretación cuando corresponda. Información de los antígenos/kits utilizados. Firma del Director Técnico del Laboratorio. Observaciones. Paginación x de y. Que conste en todas las páginas N° del protocolo y N° de RENSPA. Página 15 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de Brucelosis en la República Argentina Animales a examinar: Hembras vacunadas mayores de 18 meses Animales no vacunados mayores de 6 meses * * Solo en bovinos Página 16 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PRUEBAS SCREENING CON ANTÍGENO TAMPONADO EN PLACA (BPAT y RBT) PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Brucella spp Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos IgM específicos. DESARROLLO Materiales ▪ ▪ ▪ ▪ Micropipetas de10-100 µl. Gradillas. Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio marcada con cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para evitar la evaporación de las muestras. Mezcladores de acero o plástico. Equipos ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). Freezer con temperatura controlada (-20ºC ± 5°C). Vórtex. Centrífuga. Timer. Reactivos ▪ ▪ Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%. Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%. Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ±3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. ▪ ▪ ▪ Suero control interno positivo. Suero control interno negativo. Cada Laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE BPAT ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Garantizar la homogeinización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de ambos lados de la misma. Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 µl de suero, previo mezclado con vortex. Utilizar un tip o punta de pipeta para cada suero. Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno. Página 17 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �▪ ▪ Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro. Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeinizar la mezcla. Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa, permaneciendo la luz apagada. Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos. A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura. Figura 2: Aglutinoscopio EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE ROSA DE BENGALA ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT. Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 µl de suero. Utilizar un tip para cada suero. Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero. Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno, abarcando una superficie circular de aproximadamente 2 cm. de diámetro. Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente. Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco. En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OIE recomienda utilizar la prueba de Rosa de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno. Lectura a los 4 minutos, como se detalle en la explicación anterior. Página 18 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aún siendo finos (no confundir con aglutinaciones inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de SAT/2-ME, FPA, CELISA o FCT. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos. Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias. Figura 3: Lectura BPAT/RBT BPAT RBT Informe de resultados Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas Positivo Negativo + - POS NEG P N Criterios de aceptación del resultado En paralelo a las muestras problemas se dispensan los sueros controles internos negativo y positivo. Para aceptar los resultados, ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si los controles no arrojan la lectura esperada, se debe revisar las posibles causas, calidad de los sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc. Página 19 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PRUEBAS DE SERO-AGLUTINACIÓN LENTA EN TUBO (SAT/ 2-ME) Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión. El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que causa un determinado grado de aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución. La prueba de 2-Mercaptoethanol es una prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2- mercaptoethanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aún cuando las subunidades están integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación. La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos de la clase IgG. DESARROLLO Materiales ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Micropipetas de10-100 µl. Gradillas. ▪ Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente). El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de vidrio. Probetas (100ml y 1000ml). Pipetas 1, 2, 5 y 10ml. Recipientes de vidrio de volúmenes variados. Propipetas. Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10ml. Reactivos 1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%. Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ±3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad 2. Suero control interno positivo. 3. Suero control interno negativo. Cada Laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Página 20 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Equipos: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). Freezer con temperatura controlada (-20ºC ± 5°C). Estufa con temperatura controlada (37ºC ± 2). Balanza. Vórtex. Centrífuga. Timer. Termómetro calibrado. Drogas y Soluciones: (Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga) ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Cloruro de Sodio p.a. Fenol p.a. 2- Mercaptoethanol p.a. Solución salina al 0.85%. Solución salina fenolada al 0,5%. Ejecución del ensayo a) Consideraciones generales: ▪ ▪ Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse por las técnicas de SAT y 2-Mercaptoethanol, CELISA, FPA o FCT. La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación en tubo, no sólo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción, de la aglutinación específica de la unión antígeno-anticuerpo. b) Desarrollo: Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera: ▪ Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. ▪ Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC al menos una hora antes de la ejecución del ensayo. ▪ Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos de 10 minutos (No usar vórtex). ▪ Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8 tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla con el número de protocolo. ▪ Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema. En los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja un espacio libre y en los 4 tubos siguientes de la misma hilera, se realiza la prueba de 2-ME. ▪ Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer tubo, 40 µl se distribuyen en el segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el cuarto. ▪ Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de suero en los tubos de 2-ME. ▪ Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo y, un control de soluciones y antígeno sin suero. Página 21 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �▪ Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución de 2mercaptoethanol (0,1 M) en cada tubo del grupo de 2-ME y mezclar muy bien agitando la gradilla. ▪ Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución salina fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT. ▪ Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno de SAT diluido al 2 % (0,09 %) en solución salina 0,85%. ▪ Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa. Incubación La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 hs. y tiene por objeto obtener en el tiempo más corto posible el máximo de aglutinación. Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la estufa durante el transcurso de las 40-48 hs. de la incubación, para verificar la estabilidad de la estufa. c) Lectura e interpretación de resultados Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las pruebas contra el fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz que atraviese los tubos. La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el fondo del tubo por gravedad, determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo, manteniéndose los grumos firmes después de una leve agitación del tubo. La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar tanto en la claridad/turbidez de las mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los grumos al agitar suavemente el tubo. El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa aglutinación en el tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la turbidez, manteniéndose los grumos firmes a pesar de una agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI/ml de aglutinación en SAT o en 2-ME. El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo (+), incompleto (I) o negativo (-). Aglutinación completa es aquélla en que el líquido de la mezcla suero- antígeno aparece límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos. Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una suave agitación no rompe los grumos. Negativa es aquélla en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida aparece turbia y una suave agitación no revela grumos. Fenómeno de zona En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas, pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada “fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el suero en las diluciones más bajas, provocando una aglutinación no visible por estar fuera de la zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo. Página 22 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME Página 23 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Informe de Resultados Ejemplo Negativo Neg I 25 25 1/25 I: Incompleto Tabla 2: Interpretación de los resultados para Hembras Bovinas mayores de 18 meses de edad vacunadas con vacuna Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACION - NH * NH NEGATIVO + ≤ 50 - NEGATIVO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - SOSPECHOSO + I 200 - SOSPECHOSO + 200 - POSITIVO + 25 a 50 I 25 NEGATIVO + ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO + ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO * NH: No se hace Tabla 3: Interpretación de los resultados para animales no vacunados (Bovinos y otras especies) mayores de 6 meses de edad BPA SAT 2-ME INTERPRETACION - NH NH NEGATIVO + 25 - NEGATIVO + I 50 - SOSPECHOSO + 50 - SOSPECHOSO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - POSITIVO + 200 - POSITIVO + ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO Página 24 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Preparación de Soluciones para las pruebas de SAT/2-ME SOLUCIÓN SALINA 0,14 M • • Cloruro de Sodio Agua destilada 8,5 g 1000 ml SOLUCIÓN SALINA FENOLADA Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. SOLUCIÓN 2-MERCAPTOETHANOL 0,1 M • 2-Mercaptoethanol • Solución salina 0,14M. (No utilizar solución salina fenolada) 7,8ml 992,2ml El 2-Mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire. Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente (22ºC ± 4 ºC). Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en lo posible con máscara de gases o en cabina de extracción. NUNCA pipetear con la boca. La solución de 2-Mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una semana a temperatura ambiente (22ºC ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. SOLUCIÓN DE ANTÍGENO SAT (WRIGHT) al 2% • • • Solución salina 0,14M (no utilizar solución salina fenolada) 98ml Antígeno SAT (Wright) (4,5%) 2ml • La solución de antígeno al 2% se puede conservar por una semana en heladera (5ºC ± 3ºC). Descartar toda aquella solución que presenten turbidez o signos de contaminación. Página 25 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE (PAL o MRT) solo para Bovinos La prueba se diseño para detectar la presencia de anticuerpos en leche de bovinos. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie, formando una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural. El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso. La prueba de anillo en leche se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la brucelosis. Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las pruebas serológicas para identificar los infectados. Materiales ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de khan de vidrio claro y completamente limpio. Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml. Gradillas. Timer. Reactivos 1. Antígeno PAL con volumen celular aprox.4%. Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad 2. 3. 4. Muestras de leche refrigerada (No congelada) Solución de formalina 1%. Muestras de leche controles positivo y negativo. Equipos: ▪ ▪ ▪ Heladera con temperatura controlada (5ºC ± 3 ºC). Estufa con temperatura controlada (37 ºC ± 2ºC). Termómetro calibrado. Toma de la muestra La prueba se lleva a cabo con la muestra de leche de tanque. Si es necesario, las muestras se pueden pre tratar con un conservante (formalina al 0,1%) durante 2–3 días a 5°C ± 3°C antes de su utilización. En el campo, tan pronto se ha llenado el tarro y antes de que la crema suba, revolver bien el contenido y tomar unos 50 ml de leche. Si es necesario, agregar 1 ml de solución de formalina al 1% por cada 10 ml de leche. Las muestras, bien identificadas, se transportan refrigeradas hasta el laboratorio. Página 26 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Ejecución del ensayo Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura de 5ºC ± 3 ºC hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas). Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta ni conservadas durante más de 72 horas. Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). Garantizar la homogeinización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100mm o tubo de khan. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes. Incubar en estufa a 37ºC ±2 ºC, durante una hora. Lectura - Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul. + ++ +++ ++++ Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual. Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche. Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color. Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca. Cualquier grado de + debe interpretarse como Positivo Observaciones El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba. La agitación vigorosa dificulta la realización de la prueba. El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba no se puede efectuar con leches pasteurizadas. Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la leche, se pueden obtener algunos resultados falsos positivos o dudosos. La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos. La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la interpretación de la prueba debido al descoloramiento del antígeno. La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos positivos. Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo. Página 27 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Modificación de la prueba para tanques muy grandes Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche, manteniendo constante la cantidad del antígeno (30 µl). Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (utilizándose 2 o 3 ml de leche), se añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada al tubo de ensayo y a continuación, 30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la misma forma que para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis. < 150 vacas 150 – 450 vacas 451- 700 vacas 1 ml de leche 2 ml de leche 3 ml de leche Figura 5: Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras de pool de leche Página 28 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ENZIMOINMUNOENSAYO INDIRECTO (I ELISA) (Para suero o leche) Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis en la República Argentina con el valor de corte establecido por SENASA. El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección y/o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de "señal" que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: 1. Fijación insoluble del antígeno al soporte/placa, específico para los anticuerpos objeto de estudio (generalmente en los kits comerciales la placa ya está preparada con el antígeno pegado a la misma). 2. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados, solo si se indica en las instrucciones. 3. Adición de los sueros/leches controles y sueros/leche problemas, en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos, estos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 4. Incubación. 5. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o uniones inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del ensayo. 6. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti IgG de especie), los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 7. Incubación. 8. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado. 9. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 10. Frenado. 11. Lectura colorimétrica de la placa. Página 29 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 6: Esquema ELISA Indirecto Materiales y Equipamiento ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450nm). Computadora. Agitador orbital de placas. Lavador manual o automático de placas. Heladera (5 ± 3 ºC) y freezer (-20 ± 5ºC). Estufa de incubación (37 ± 2 ºC). Vórtex. Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada). Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10µl, 5 - 50 µl, 50 -200 µl, 200 - 1000 µl). Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl). Propipetas. Dispensadores automáticos. Timer. Selladores de placas de acetato o parafilm. Cubetas plásticas para pipetas multicanales. Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o placas fondo en U. Crío tubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros. Gradillas. Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc. de distintos volúmenes). Toallas o papel absorbente. Página 30 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Reactivos Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el SENASA, incluyen: • • • • • • • Buffer de lavado Buffer de dilución Conjugado Sustrato cromógeno Solución de frenado Sueros controles Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado A continuación se citan algunas precauciones a tener en cuenta para ejecutar la técnica de Elisa: � � � � � � � � � � � � Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de su utilización. No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits. Evitar cualquier contaminación de los reactivos. No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad. Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo. Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación/dilución de los reactivos que se empleen en el ensayo. Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo. Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador. Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice el kit. El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se recomienda retirar del frasco únicamente el volumen que se vaya a utilizar y nunca devolver el sustrato sobrante al frasco original. La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la piel lavar inmediatamente con abundante agua. Figura 7: Placa de Elisa Página 31 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ELISA POR COMPETICIÓN / BLOQUEO La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una matriz sólida (Microplaca de 96 pocillos). A continuación se añade la dilución de los sueros y el anticuerpo monoclonal, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos junto con el antígeno adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo anti-monocolonal conjugado con enzima. Es importante mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero normal (no infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies. La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato / cromógeno. Después de un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos del ensayo la placa debe ser lavada debidamente. En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el anticuerpo monoclonal se liga con el epítope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos antiBrucella (suero positivo) estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epítope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos post vacunales por B. abortus cepa 19, compiten en menor grado con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja, resultando usualmente en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores al sangrado). Diversos CELISA / bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras contengan anticuerpos frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen este tipo de anticuerpos, el conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa. Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato adecuado el cual, desarrollará una reacción colorimétrica en presencia de la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con enzima). De este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra evaluada no contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y, la ausencia de color indicará que la muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos. Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación de las muestras: Idem Elisa Indirecto. Figura 8: CELISA Página 32 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 4: Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA Señal Posible causa Solución Color irregular 1.Error de pipeteo 2.Falta de mezcla de reactivos 3.Falta de lavados Práctica Mejorar técnica Precaución No hay color 1. Se omitió el substrato 2. Errónea concent. Substrato 3. Substrato con pH erróneo 4. Conjugado muy diluido 5. Se omitió el conjugado Revisar Revisar Controlar pH Revisar Revisar Color parejo en toda la placa 1. Conjugado muy concentrado 2. Falla en el lavado 3 Substrato contaminado Controlar Mejorar técnica Revisar 1. Reacción inespecífica 2. Material de vidrio sucio 3. Agua de mala calidad 4. Poco detergente (Tween 20) 5. Tampones contaminados Cambiar solución de lavado Mejorar lavado Controlar calidad Revisar Preparar soluciones nuevas 1. Substrato muy concentrado 2. Conjugado muy concentrado 3. Solución substrato con pH erróneo 4. Concent. Cromógeno errónea Revisar Controlar dilución Controlar Revisar 1. Substrato muy diluido 2. Conjugado muy diluido 3.Solución substrato con pH erróneo 4.Concentración Cromógeno errónea 5.Concent de Tween errónea Revisar Revisar dilución Revisar Revisar Revisar 1. Incubación despareja 2. Resecación por aire 3. Tampón de lavado residual Utilizar estufa Mantener la placa cubierta Eliminarlo Elevado color de fondo “background” Desarrollo de color muy rápido Desarrollo de color muy lento Efecto borde Página 33 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA Protocolo ELISA Brucelosis DIRECCIÓN DE LABORATORIOS Y CONTROL TÉCNICO Fecha: Temperatura ambiente: Analista: Marca del Kit: Tipo de Elisa: Competencia Matriz: Indirecto Suero Bloqueo Leche Otros Otros Número de Lote: Vencimiento: Fecha apertura kit: Nº Placa: Muestras: Protocolo N°…… 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Firma operador Página 34 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ENSAYO DE POLARIZACION FLUORESCENTE PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Brucella EN SUERO El ensayo de Polarización Fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella tiene la capacidad de ser una prueba multi-especies, permitiendo el diagnóstico presuntivo en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y bisontes. Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con Brucella de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de los 3 meses post vacunación aproximadamente, y de los animales con reacción cruzada con bacterias gram negativas en más del 90% de los casos. A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un tubo de vidrio. A continuación la muestra es equilibrada por aproximadamente cinco minutos, posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador fluorescente para obtener una lectura blanco de referencia (auto fluorescente). A continuación el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) es agregado a la solución y luego, la muestra es equilibrada nuevamente por un mínimo de dos minutos para permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen, a continuación la muestra es leída nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos anti Brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP. El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina se ha determinado en: Bovinos: ▪ Animales negativos < 94 mP. ▪ Animales sospechosos: Los valores entre 94mP y 104 mP. ▪ Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP. Caprinos y Porcinos: ▪ Animales negativos < 85 mP. ▪ Animales positivos: valores igual o mayor a 85 mP. Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis): ▪ Animales negativos < 78 mP. ▪ Animales positivos: valores igual o mayor a 78 mP. Materiales y equipamiento: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Analizador de Polarización Fluorescente. Vórtex. Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10µl, 20 –200µl, 200–1000µl). Heladera (5 ± 3 ºC) y freezer (-20 ± 5 ºC). Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm. Material de vidrio. Termómetro de temperatura ambiental. Computadora e impresora. Reactivos Están incluidos en los kits comerciales AUTORIZADOS por el SENASA, incluyen: • • • Buffer de dilución Sueros controles positivo y negativo Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceina Página 35 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PREPARACION DE LA PRUEBA DE FPA Preparación de los Reactivos Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial. Preparación del equipamiento/instrumentos El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos los equipos previos a la ejecución del ensayo. Ejecución de la prueba En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con lo especificado en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los sueros controles no se ajusta dentro de los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado. Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por lo menos dos (2) hs. antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso. ▪ ▪ ▪ ▪ Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). Dispensar 10 µl de suero bovino (Dilución 1/100) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex evitando la formación de espuma. Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex. ▪ ▪ Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros. Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40). ▪ ▪ ▪ ▪ Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se estabilice. Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las muestras. Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y mezclar bien con vórtex. Es importante evitar la formación de espuma en la muestra En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas partículas hayan sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas puedan interferir con la lectura de la muestra dado que, la misma se basa en el Peso Molecular de las partículas en suspensión ▪ ▪ Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos minutos. Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas. Página 36 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 10: Esquema Ensayo de Polarización Fluorescente 10 µl de Suero Bovino + 990 µl de Buffer ANTIGENO 10 µl Esperar 5 min. Lectura Blanco en Polarizador Incubación 2-5 min Lectura Final en Polarizador Interpretación de los resultados Control del ensayo Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del kit utilizado según el control de calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo. Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización (mP) de la actividad del suero contra el antígeno. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Aceptación de los controles Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será rechazada y los controles y las muestras deben ser repetidas. Página 37 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �FIJACIÓN DE COMPLEMENTO La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional para el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina. La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos ¨capaces de fijar¨ el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de ¨Animal infectado¨. La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente. La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera el antígeno y el suero problema (cuyo complemento se destruyó previamente por calentamiento a baño maría) se incuba en presencia de complemento de cobayo. Después de dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un ¨sistema indicador¨ o ¨sistema hemolítico¨ formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como complejo antígeno-anticuerpo alternativo. La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmuno complejos en la primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de sus factores. En la segunda etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante la presencia del ¨sistema hemolítico¨. El resultado es la ausencia de hemólisis (resultado positivo). Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es indicadora de la existencia de complemento libre en la segunda etapa de la reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmuno complejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo). Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2%, 2,5% o al 3%). Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina) hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo. Variantes para la prueba de FCT: ▪ ▪ La macrotécnica, se realiza en tubos de Khan a un volumen final de 1 ml. La microtécnica, se realiza en placas de polipropileno de 96 pocillos, con un volumen final de 100 µl. Equipos - Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a 5000 µl. - Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl. - Centrifuga. - Centrífuga de placas. - Estufa con temperatura controlada (37ºC ± 2ºC). - Heladera con temperatura controlada (5 ± 3°C). - Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5°C). - Agitador de microplacas. - Vórtex. -Baño térmico. - Espectrofotómetro. Materiales: -Tubos de ensayo. - Material de vidrio de volúmenes varios. - Gradillas. - Film para cubrir placas. - Puntas de pipetas (Tips). Página 38 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �- Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. - Cubetas o reservorios de plástico para reactivos. Reactivos Solución buffer: Ver Anexo FCT I Solución GR 2%: ver Anexo FCT II Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III Sistema hemolítico Anexo FCT IV Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V Titulación Antígeno: Ver Anexo FCT VI Sueros controles Suero control positivo bovino (SENASA suero patrón Nacional BR 01/05). Suero control negativo bovino (SENASA suero patrón Nacional BR 03/05). Manejo y conservación de las muestras - Conservar los sueros en heladera (5 ± 3ºC) no más de dos días, para períodos mayores, conservarlos a –20 ± 5ºC. - Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento. - No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis. - Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos. Inactivación de los sueros Sueros patrones - Suero BR 01/05: Reconstituir el suero control positivo bovino liofilizado con 1 ml de agua destilada estéril. Realizar una dilución 1/12,5 con SB e inactivar durante 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC, luego alicuotar y conservar a -20 ± 5ºC. - Suero BR 03/05: Reconstituir el suero control negativo bovino liofilizado con 1 ml de agua destilada estéril. Inactivar durante 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC, luego alicuotar y conservar a –20 ± 5º C. Muestras de suero Las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC para eliminar el complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño termostático se controla mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de exposición de las muestras. - Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre 60ºC – 63°C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación de 30 minutos). - Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. Volumen de suero sugerido a inactivar: 200 µl. - La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejan a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 hs, las muestras ya inactivadas se conservan a (-20 ± 5ºC). Página 39 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Condiciones del ensayo El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2ºC) y se utilizan los siguientes reactivos en volúmenes de 25 µl: a. b. c. d. Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB. Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100%). Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una solución de suero hemolítico en SB que contenga 2UH (100%) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero en SB al 2%. Ejecución Dependiendo del número de muestras a realizar, se podrá incluir los controles en la misma placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles. a) Dilución de las muestras de suero - El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U, mediante la - utilización de volúmenes de 25 µl. La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 1 1/2 Suero 25 µl SB 25 µl 1/4 25 µl de la dilución 1/2 25 µl 1/8 25 µl de la dilución 1/4 25 µl 1/16 25 µl de la dilución 1/8 25 µl 1/32 25 µl de la dilución 1/16 25 µl 1/64 25 µl de la dilución 1/32 25 µl 1/128 25 µl de la dilución 1/64 25 µl 1/256 25 µl de la dilución 1/128 25 µl b) Sueros controles - Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización de volúmenes de 25 µl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla en la tabla 2. La homogeinización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 2 Suero positivo 01/05 SB - 1/12,5 1/25 25 µl 25 µl - 25 µl 1/50 25 µl de la dilución 1/25 25 µl 1/100 25 µl de la dilución 1/50 25 µl 1/200 25 µl de la dilución 1/100 25 µl 1/400 25 µl de la dilución 1/200 25 µl 1/800 25 µl de la dilución 1/400 25 µl 1/1600 25 µl de la dilución 1/800 25 µl Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.). c) Controles del ensayo • • Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado en la placa 25 µl/pocillo de SB, 25 µl/pocillo de C y 25 µl/pocillo de antígeno Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 50 µl/pocillo de SB y 25 µl/pocillo de C. Página 40 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �• Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 75 µl/pocillo de SB. d ) Disposición de los sueros en la placa Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo en U (25 µl/pocillo) según indica la tabla 3. Tabla 3 A B C D E F G H 1 Control positivo 1/12,5 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 2 3 Control muestra negativo 1/2 1/2 1/4 1/4 1/8 1/8 1/16 1/16 1/32 1/32 1/64 1/64 1/128 1/128 1/256 1/256 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 c) Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento - Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras. - Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control negativo) y 1/12,5 (control positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder anticomplementario (PAC) de cada suero. d) Primera incubación en caliente - Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos. - Incubar a 37 ± 2ºC durante 30 minutos. e) Dispensado del sistema hemolítico - Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e incubar a 37 ± 2ºC durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo FCT IV. - Finalizada la primera incubación, dispensar 25 µl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los pocillos de las placas incluida la placa de los controles. f) - Segunda incubación en caliente Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos. Incubar a 37 ± 2ºC durante 30 minutos. g) Centrifugación de la placa - Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos o bien dejarla en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura. Página 41 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Expresión de resultados El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos) de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción positiva se cuantificará mediante la determinacion del título y su grado de hemólisis. Reacción positiva - Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo. - El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y cosignarse mediante un sistema de cruces. Figura 11: Placa fijación de complemento 0 % de hemólisis Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de 25% de hemólisis +++ GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de 50% de hemólisis ++ GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy 75% de hemólisis + tenue de GR 100% de hemólisis Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR ++++ Página 42 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Determinación del título del suero Será la inversa de la dilución mas alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este grado de fijación será informado mediante el sistema de cruces descripto y convertido a UIFCT. - En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier valor ≥40 UIFCT (1/8 ++). - Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo cualquier valor ≥20 UIFCT (1/4 ++). Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento - El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón internacional OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se basa en el Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia y el Manual de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario. Gobierno de Aragón. España. Tabla 4. Tabla 4. Interpretación en UIFCT Dilución 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 % de Fijación del Complemento + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ 1000 UIFCT (1/200) 16,6 20 23,2 26,6 33,2 40 46,4 53,2 66,4 80 92,8 106,4 132, 8 160 185,6 212,8 265,6 320 371,2 425,6 531,2 640 742,4 851,2 1062,4 1280 1484,8 1702,4 Página 43 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Controles del ensayo La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados: Controles Suero control positivo Suero control negativo Control de poder anticomplementario de los sueros Control de ausencia de poder anticomplementario del antígeno Resultado Esperado 50 % de fijación (++) - en la dilución 1:200 que corresponde a 1000 UIFCT (Brucellas lisas) 100% de hemólisis en todos las diluciones, ausencia de fijación de complemento 100% de hemólisis ausencia de fijación del complemento en la dilución 1:2 (sin antígeno) 100 % hemólisis Control del sistema hemolítico sin C 0% de hemólisis Control del sistema hemolítico con C 100% de hemólisis Criterio de aceptación del análisis: El ensayo se debe considerar APROBADO / NO APROBADO a) APROBADO: • Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento dan los resultados pre-establecidos. • El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con una variación máxima de (± 2 ++). • El control negativo da un resultado Negativo. b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se repite el ensayo. La presencia de, al menos, un 25% de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A (dilución ½) indica poder anticomplementario en la muestra. En este caso, se informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción de la toma de muestra. Página 44 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar una escala visual del siguiente modo: En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 900 µl de SB 1X. En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 700 µl de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR (solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X para mantener la presión osmótica. Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0% de hemólisis y el 100% de hemólisis en la prueba. De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS REACTIVOS 0% EN µl Solución 0 hemolisada Suspensión de 100 glóbulos rojos 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Página 45 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT I: Solución Buffer (SB) - Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1, luego conservar en refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez producto de contaminación. Solución de stock calcio 0,3M y magnesio 1 M Ca Cl2. 3,7g Mg Cl2. 9,5 g Agua destilada - 100 ml Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85% (NaCl2 8,5 g/ agua destilada 1 litro). La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 – 7,4. Luego de su uso conservar en refrigeración por 7 días. Página 46 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT II: Preparación de la suspensión de GR 2 % a) Lavado de los GR Homogeinizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos. En un tubo cónico re-suspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5 volúmenes de SB, luego homogeinizar cuidadosamente. Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repetir la re-suspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente descripta y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. Realizar la última re-suspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 10 minutos. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante el cual debe estar libre de hemólisis. b) El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2% se podrá realizar por medio de dos técnicas. • • Método espectrofotométrico. Método en cámara de Neubauer. Método espectrofotométrico: Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2%). Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5 ml agua destilada en la celda o tubo del espectrofotómetro. Determinar la lisis 100% de los GR realizando una dilución 1/15 con agua destilada, agregando en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2%. Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm. La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar según el modelo de espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la concentración de GR al 2 %. Método en cámara de Neubauer: - Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2%). Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la cámara. La suspensión deberá tener 5,4(± 0,2) X 108 GR/ml. Página 47 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT III: Titulación Hemolisina Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensa los siguientes volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex. Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina N° de tubo Dilución SB (ml) 1 1/50 4,9 2 1/100 2 3 1/150 7,45 4 1/200 1 5 1/250 12,5 Hemolisina 100 µl 2 ml T1 50 µl 1 ml T2 50 µl 6 1/500 1 1 ml T5 7 1/1000 6 2 ml T5 8 1/2000 1 1 ml T7 9 1/3000 2 1 ml T7 10 1/4000 3 1 ml T7 11 1/5000 4 1 ml T7 12 1/6000 5 1 ml T7 13 1/7000 3 0,5 ml T7 14 1/8000 3,5 0,5 ml T7 15 1/9000 4 0.5 ml T7 Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina - En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo de SB excepto de las columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2). - En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la batería de tubos de ensayo, según protocolo de la tabla 1. - Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se realiza mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl/pocillo de la fila B y pasar a la fila C. Volver a homogenizar. Recoger 25 µl/pocillo de la fila C y pasar a la D. Homogeinizar y recoger 25 µl/pocillo y descartar. - De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H. - Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl A de T1 de T1 de T1 de T2 de T2 de T3 de T3 de T4 de T4 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl B de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB C 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl D de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB E 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T5 de T5 de T6 de T7 de T8 de T9 de T10 de T11 de T12 de T13 de T14 de T15 F 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl G de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl H de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB Página 48 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/50 1/50 1/100 1/100 1/150 1/150 1/200 1/200 B 1/100 1/100 1/100 1/200 1/200 1/300 1/300 1/400 1/400 C 1/200 1/200 1/200 1/400 1/400 1/600 1/600 1/800 1/800 D 1/400 1/400 1/400 1/800 1/800 1/1200 1/1200 1/1600 1/1600 F 1/250 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/3000 1/4000 1/5000 1/6000 1/7000 1/8000 1/9000 G 1/500 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/6000 1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000 H 1/1000 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000 E Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos - Se prepara una suspensión de GR al 2% según lo indicado anteriormente. En este ensayo se prepara una suspension de 5 ml. - Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca. - Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos a bajas revoluciones. Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión con los anticuerpos presentes en las diluciones de hemolisina). - Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se dispensar adicionalmente otros 25 µl (esta columna actúa como control del poder hemolítico de la hemolisina). Preparación y dispensado de una solución de complemento - El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que siempre haya reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) – Ac (hemolisina diluida). - Para complementos (comerciales) que den un titulo (unidad de complemento) superior a 1/90, debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que den títulos inferiores, la solución a preparar será de 1/10 – 1/20 (tabla 4). Tabla 4: Dilución del complemento Solución de complemento 1/20 Solución de complemento 1/30 TV 5,7 ml 5,8 ml Complemento 0,3 ml 0,2 ml - Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C, D, F, G y H, excepto en los pocillos de la columna 1. - Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Incubación - Incubar a 37 ± 2° C, durante 30 minutos. Página 49 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Cálculos y expresión de resultados El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consigna mediante un sistema de cruces. Tabla 5. Tabla 5: Expresión de resultados ++++ + Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR +++ ++ 0 % de hemólisis 25% de hemólisis 50% de hemólisis 75% de hemólisis 100% de hemólisis Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente. Cálculos de los resultados - Se define la unidad de hemolisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100% de los eritrocitos en el pocillo. - Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de hemolisis presentan un grado de hemolisis similar. - Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100% de hemolisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor concentración de hemolisina). - La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir 2 UH 100%. - Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000 - DT= 2 x 1/1000= 1/500 Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas de trabajo. - Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5ºC para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote, fecha y cantidad de hemolisina diluida. Página 50 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT IV: Sistema hemolítico - - Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema depende del número de placas a utilizar (1 placa= 96 pocillos fondo en U). Ejemplo para dos placas: 2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de perdidas) Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2% y luego 2,5 ml de hemolisina al título de uso agitando suavemente para homogenizar las dos suspensiones e incubar a 37° C ± 2° C, durante 15 minutos. Página 51 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT V: Titulación Complemento Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema enzimático denominado ‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de fijación del complemento es la de detectar uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean glóbulos rojos, es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la reacción de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el papel de antígeno y el suero de conejo (hemolisina) de anticuerpos. El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo llevar a temperatura de laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacara de la heladera en el momento de su utilización. Si se provee que se va a utilizar más de un vial se juntaran todos en uno y se titulará el conjunto. Preparación de las soluciones “madres” del complemento - Realizar 6 diluciones ‘’madres’’ del complemento, empleando para ello tubos de ensayo. Tabla 1 de este anexo. - En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se homogeiniza perfectamente mediante un agitador. Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 SB µl 725 850 975 1100 1225 1350 C µl 25 25 25 25 25 25 Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB - En la filas B, C y D de una placa fondo en U dispense 25 µl/pocillo de SB (tabla 2). - En la filas A de la placa dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de complemento por duplicado según protocolo descripto en tabla 1. - Con una pipeta multicanal recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se propiciara mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensación de la pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila C. Vuela a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogeinice y recoja 25 µl/pocillo y descártelos. - Las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3. - Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa. - Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB A B C D 1 50 µl de T1 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 2 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 3 50 µl de T4 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 4 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 5 50 µl de T5 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 6 50 µl de T6 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 7 50 µl de T1 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 8 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 9 50 µl de T4 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 10 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 11 50 µl de T5 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 12 50 µl de T6 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB E F G H Página 52 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 3. Diluciones finales del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 B 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 C 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 D 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 E F G H - Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ±2 °C durante 15 minutos Dispensado del sistema hemolítico - El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto anteriormente. - Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl/pocillo del SH en todos los pocillos de la placa. - Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. - Incube en estufa a 37 ±2 °C durante 30 minutos Centrifugación de la placa - Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces: Tabla 4 ++++ + Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR +++ ++ 0 % de hemolisis 25% de hemolisis 50% de hemolisis 75% de hemolisis 100% de hemolisis Cálculos de los resultados - Se define la unidad de complemento (UC) o Unidad Hemolítica como la dilución más alta que permita la lisis del 100% de los eritrocitos en el pocillo. - Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemolisis similar. - Se elige la UC la dilución más alta que de 100% de hemolisis. - La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC. Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el análisis de 2 placas según el procedimiento descripto Ello supone un volumen total de solución de complemento de 2 placas x 2,4ml/placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en Página 53 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �previsión de perdidas) a. Supongamos que UC = 1/100 DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50 Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro: En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml b. Por tanto las proporciones será: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml de SB. Control de 2 Unidades de complemento (2 UC) - Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizará diluciones del complemento que contengan 2 unidades, 1,5 unidades, 1 unidad. 0,75 unidades y 0,5 unidades. - Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia. Tabla 5. Tabla 5: Diluciones del complemento Tubo 1 Tubo 2 (2 unidades) (1,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 SB (µl) 0 100 - Tubo 3 (1 unidades) 200 200 Tubo 4 (0,75unidades) 150 250 Tubo 5 (0,5unidades) 100 300 Se dispensaran por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en los correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de SB. Tabla 6 Tabla 6. Unidades del complemento en la placa A B C D E F G H 1 2U 2U 2 1, 5U 1, 5U 3 1U 1U 4 0,75 U 0,75 U 5 0,5 U 0,5 U 6 7 8 9 10 11 - Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2 – 4 minutos e incube en estufa a 37°C ± 2° C durante 15 minutos - Luego repita lo descripto agregando el SH Lectura del análisis: - Pocillo con 2 Unidades: 100% de hemolisis - Pocillo con 1,5 Unidades: 100% de hemolisis - Pocillo con 1 Unidades: 100% de hemolisis o traza de GR en suspensión - Pocillo con 0,75 Unidades: 0% a 75% de hemolisis - Pocillo con 0,5 Unidades: 0% a 50% de hemolisis CONTROL DE CALIDAD - El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un grado de reacción similar. En caso contrario se repetira el análisis. - Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el 100% (N) de hemólisis (las mas bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de hemólisis (las mas alta). En caso contrario se repetira el análisis. - En el control de 2 Unidades de complemento deben dar los resultados preeestablecidos. El análisis debe informarse como APROBADO/NO APROBADO en el apartado de observaciones de la planilla de titulación del complemento. En caso de no aprobado, se repite el proceso. Página 54 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) 12 �Anexo FCT VI: Titulación Antígeno Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 % Se trata de determinar lo que se denomina UA (Unidad Antigénica) que corresponde para cada lote de antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los sueros problema, en la cantidad suficiente para fijar el complemento. El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros problema y que serán capaces de fijar el complemento. Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento. Preparación de diluciones “madre” de antígeno Se preparan tres diluciones previas en tubos, donde se dispensaran en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de antígeno, en el segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno y en tercero 1250 µl de SB y 10 µl de antígeno lo que da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125 respectivamente. Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno En una placa de fondo en U se dispensa 25 µl de SB en todos los pocillos salvo en la columna 1 y los pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizaran hasta la columna 9 (Tabla 1). En la columna 1 se pondrá 50 µl de las soluciones madres del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de forma simple (tabla 1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la columna 1 a la columna 9 y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10, H11 y H12. Es decir se pasan 25 µl de la columna 1 a la 2, se homogeiniza y se pasa otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente y se elimina los 25 µl que sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12. Tabla 1 Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/50 1/75 1/125 B 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/100 1/150 1/250 1/200 1/300 1/500 C D 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/400 1/600 1/1000 E 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/800 1/1200 1/2000 1/1600 1/2400 1/4000 F G 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/3200 1/4800 1/8000 H 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/6400 1/9600 1/16000 Dispensado de sueros controles positivo y negativo Seguidamente se dispensa 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la fila A, B D E, G y H salvo en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl de suero control negativo y servirá como control de hemolisis. El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en la reacción de fijación del complemento. Dispensado de una solución de complemento Posteriormente se dispensa 25 µl de complemento a todos los pocillos según el título obtenido previamente, Se agita la placa 2 - 4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37° C ± 2° C. Página 55 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Dispensado del sistema hemolítico Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos. Luego se agita la placa 2 - 4 minutos e incubará durante otros 30 minutos a 37 ° C ± 2° C. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignara mediante un sistema de cruces. Tabla 2 ++++ + Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR +++ ++ 0 % de hemolisis 25% de hemolisis 50% de hemolisis 75% de hemolisis 100% de hemolisis Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente Cálculos de los resultados - Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación completa (0% de hemolisis) - Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de antígeno presentan un grado de hemolisis similar. - Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemolisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor concentración de antígeno). - La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA. Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800: DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400 Página 56 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �NORMATIVA VIGENTE Consultar en • • • http://www.senasa.gob.ar/normativas https://www.boletinoficial.gob.ar/ http://www.infoleg.gob.ar/ LEY 24.696: Declárase de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio Nacional. RESOLUCIÓN SENASA 67/2019: Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la REPÚBLICA ARGENTINA. Se aprueba el Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la REPÚBLICA ARGENTINA, de aplicación obligatoria en todo el Territorio Nacional, excepto en la Provincia de TIERRA DEL FUEGO, ANTÁRTIDA E ISLAS DEL ATLÁNTICO SUR. RESOLUCIÓN SENASA 857-E/2017: Zona Libre de Brucelosis Ovina y Caprina a Brucella melitensis. RESOLUCIÓN SENASA 372-E/2017: Aprobación del Plan Nacional de Control de Brucelosis Caprina. RESOLUCIÓN SENASA 98/2016: Comercialización de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis. Los laboratorios elaboradores y/o importadores y/o sus distribuidores autorizados por el servicio nacional de sanidad y calidad agroalimentaria (Senasa), solo pueden efectuar ventas de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis a los laboratorios inscriptos en la red nacional de laboratorios del Senasa, que se encuentren debidamente habilitados para el rubro diagnóstico de brucelosis. RESOLUCIÓN SENASA 63/2013: Se aprueban los requisitos y procedimientos que deben cumplir los productores agropecuarios para que sus establecimientos obtengan la certificación oficial como libre de brucelosis porcina y para incorporar sus rodeos al Registro Nacional de Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina. RESOLUCIÓN SENASA 246/2007: Requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se dediquen a la elaboración de productos destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis Animal y la Tuberculosis Animal. RESOLUCIÓN SENASA 438/2006: Adóptese el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. Técnicas que lo conforman. RESOLUCIÓN 736/2006: Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos SANIDAD ANIMAL Y VEGETAL. Créase la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. Marco normativo para la inscripción en el Registro de la mencionada Red. Excepciones. RESOLUCIÓN SENASA 79/2003: Adoptar la Técnica de I-ELISA en Leche para el diagnóstico de Brucelosis Bovina en establecimientos lecheros RESOLUCIÓN SENASA 1484/1993: Normas para la Elaboración, fraccionamiento, distribución, expendedor para los reactivos destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal. Página 57 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �INFORME DE LA SUBCOMISIÓN TÉCNICA DE LA COMISIÓN NACIONAL DE BRUCELOSIS para el cambio del título de corte de la prueba de 2-ME (2006) Integrantes: Dr. Eduardo Bagnat, SENASA; Dr. Eduardo Moras, Fac. Vet UBA; Dra. Marcela Martínez Vibot, Fac. Vet UBA; Dr. Luis Samartino, INTA; Dra. Susana T. de Echaide, INTA; Dra. Irene Walsh, AAVLD; Dr. Guillermo López, DIPRODESA; Dra. Cecilia Di Lorenzo, Coleg. Med. Vet, Bs. As; Dra. Ana M. Nicola, SENASA. CAMBIO DEL PUNTO DE CORTE DE LA PRUEBA 2- MERCAPTOETANOL Se decidió cambiar la interpretación oficial del resultado de la Prueba de aglutinación, del 2Mercaptoetanol para los bovinos. Será considerado Reactor Serológico Positivo a todo animal que en la Prueba de aglutinación del 2Mercaptoetanol, presente reacción de aglutinación en la dilución 1/50 (sea esta reacción completa o incompleta) o mayor siendo esta realizada conforme al Manual de Brucelosis de la DILACOTSENASA. Todo animal cuya reacción de aglutinación en la Prueba del 2-Mercaptoetanol se presente únicamente en la dilución 1/25, sea esta completa o incompleta, será considerado seroreactor Negativo. Datos analizados INTA Castelar Proporcionó a la subcomisión Técnica de Brucelosis el resultado del diagnóstico serológico sobre un total de 1672 sueros de diversos establecimientos que fueran remitidos a esa unidad de diagnóstico y a los cuales se le realizara las Pruebas de Fijación de Complemento, SAT y 2-ME. Siendo que se observaba, por parte de especialistas y profesionales de campo, reacciones que no superaban la dilución 1/25 en la Prueba del 2-Mercaptoetanol y muchas de las cuales no reaccionaban en la dilución 1/50 en la Prueba del SAT y que además ocurrían en animales de establecimientos cuya epidemiología no manifestaba indicios de presencia de la enfermedad, se consideró la necesidad de analizar el error de diagnóstico que se producía en este estrato reactor serológico tomando como referencia la Prueba de Fijación de Complemento (estándar deoro). Del total de 1672 sueros, 170 sueros (10%) reaccionaron sólo en la dilución 1/25 al 2-ME y fueron a su vez Negativos a la FC` y no superaron la dilución 1/50 al SAT. Por otra parte hubo 6 sueros (0,3%) con ese nivel de reacción al 2-ME y al SAT, que resultaron Positivos a la Fijación deComplemento. 170 sueros resultaron falsos positivos (FP), esto es reactores 1/25 al 2-ME y Negativos a la FC` y, 6 sueros resultaron Verdaderos Positivos (VP) (+ 1/25 al 2-ME y Positivos a la FC`). La relación FP/ VP fue de 35/1 EE INTA RAFAELA Sobre un total de 801 sueros 51 (6,3%) se encontraban en ese estrato reactor (FC` Negativo, SAT 1/50 o menos y 2-ME 1/25). Hubo 2 sueros (0,2%) FC` Positivo, SAT 1/50 o menos y 2- ME 1/25 51 sueros resultaron FP y 2 sueros resultaron VP La relación FP/VP fue 51/2= 25/1 Página 58 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Conclusión: La cantidad de Falsos Positivos que cuesta detectar (1) uno verdadero positivo, en el estrato de reactor estudiado, fue de 35 y 25 en cada estudio. Ello significa un costo muy elevado. Al cambiar el nivel de corte del 2-ME de la dilución 1/25 al de la dilución 1/50 (sea esta reacción completa o incompleta), el Verdadero Positivo pasará a ser un Falso Negativo. Por otro lado se observa que en el nuevo punto de corte, reactor en la dilución 1/50 (sea esta reacción completa o incompleta), hay predominio de los verdaderos positivos (FC` Positivos) respecto de los Falsos Positivos (FC` Negativos). Esta relación costo /beneficio justifica la modificación. Debe considerarse que esta modificación se refiere a la interpretación estándar oficial de la serología que se incorpora al Manual de Procedimientos de la Brucelosis de la DILACOT-SENASA. Ello debe distinguirse de la práctica particular de saneamiento donde el profesional sanitarista puede y debe interpretar los resultados serológicos con un CRITERIO EPIDEMIOLÓGICO adecuado al caso particular de aplicación. Asimismo debe tenerse presente para los procedimientos de certificación, que en aquellos casos en que el profesional encuentre discordancia de los resultados con la condición epidemiológica, podrá solicitar que sean consideradas sus discrepancias con la interpretación oficial para su caso, Res. SENASA 438/06. Ver tabla a continuación A partir de Diciembre 2006 TABLA DE DECISIÓN (Hembras vacunadas mayores de 18 meses) BPA WRIGHT 2-ME INTERPRETACIÓN - NSH NSH NEGATIVO + 50 UI - NEGATIVO + I 100UI - SOSPECHOSO + 100 UI - SOSPECHOSO + I 200 UI - SOSPECHOSO + 200UI - POSITIVO + I 50UI I 50 UI POSITIVO Referencias I=Incompleto NSH = No sehace UI = Unidades Internacionales =Positivo + =Negativo Página 59 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ANEXO I Lavado y desinfección de manos Una vez terminada la tarea, retirarse los guantes y siempre lavarse las manos después de cada actividad en el Laboratorio Página 60 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Página 61 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ANEXO II Modelo de Planilla de emisión de resultados Página 62 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Página 63 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 1) ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D. & VERGER J.M. 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Caporale” Teramo, Italia. 10) Manual de Procedimientos Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana 2008. Servicio de Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”, Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur. 11) NIELSENK. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol., 90,447–459. 12) NIELSEN K., GALL D., JOLLEY M., LEISHMAN G., BALSEVICIUS S., SMITH P., NICOLETTI P. & THOMAS F. (1996). A homogenous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus. J. Immunol. Methods, 195,161–168. 13) NIELSEN K., KELLY L., GALL D., BALSEVICIUS S., BOSSE J., NICOLETTI P. & KELLY W. (1996). Comparison of enzymeimmunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet. Med., 26, 17–32. 14) NIELSEN K., KELLY L., GALL D., NICOLETTI P. & KELLY W. (1995). Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis.Vet.Immunol.Immunopathol., 46,285–291. 15) Norma ISO/IEC 17025/2017. 16) Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). “Manual of standards for diagnostic test & vaccines”, Capítulo 3.1.4 : Infección por Brucella abortus, B. melitensis y B. suis.) Edición 2016. Página 64 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �17) Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Código Terrestre. Capítulo 8.4: Infección por Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. 18) SENASA. Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. 2009. 19) SENASA. Manual de procedimientos de técnicas diagnósticas en Brucelosis.1998. 20) Silva Paulo, P.; Vigliocco, A.M., Ramondino, R., Marticorena, D., Bici, E., Briones, G., Gorchs, C., Gall, D., Nielsen, K. 2000. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol. 7:828-831. 21) Szyfres, B. 1983. El Diagnóstico de la Brucelosis Bovina en el Contexto de un Programa de lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA. 22) Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone, A., Marchesino, M., Nielsen, K. 1998. Evaluation of an Indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet. Med.36:211217. 23) Vanzini, V., Echaide, S., 1998. Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar anticuerpos anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos obtenidos en la EEA Rafaela. 24) STACK J.A., PERRETT L.L., BREW S.D., MACMILLAN A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples. Vet. Record, 145, 735–736. 25) WORLD HEALTH ORGANIZATION (2009). WHO Manual técnico de referencia para la higiene de las manos. 26) WORLD HEALTH ORGANIZATION (2005). WHO Laboratory Biosafety Manual, Second Edition. WHO, Geneva, Switzerland. 27) WORLD HEALTH ORGANIZATION (1986). JOINT FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS/WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BRUCELLOSIS Technical Report Series 740, Sixth Report. WHO, Geneva, Switzerland 28) WRIGHT P.F., NILSSON E., VAN ROOIJ E.M.A., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev.sci.tech.Off.int.Epiz., 12, 435–450. 29) WRIGHT P.F., TOUNKARA K., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1997). International reference Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech., 3, 824– 832. Página 65 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �BRUCELOSIS Manual de Diagnóstico Serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) 2019 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis): Manual de diagnóstico serológico Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2019 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0016 Abstract A summary of the resource. El presente Manual tiene como objetivos: ▪ Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los Laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la Brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Red de Laboratorios de SENASA. ▪ Proporcionar a la Red de Laboratorios de SENASA un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. ▪ Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse, cuando se desarrolle un procedimiento técnico. ▪ Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Las técnicas diagnósticas descriptas en el presente Manual son las internacionalmente reconocidas y recomendadas por la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) y EL SENASA. Table Of Contents A list of subunits of the resource. <div style="text-align: left;">Definiciones y Abreviaturas</div> <div style="text-align: left;">Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad en el Laboratorio</div> <div style="text-align: left;">Introducción Brucelosis</div> <div style="text-align: left;">Procedimientos de Trabajo (ingreso/rechazo de muestras)</div> <div style="text-align: left;">Prueba de screening con antígenos tamponados en placa (BPAT y RBT)</div> <div style="text-align: left;">Prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT y 2-ME)</div> <div style="text-align: left;">Prueba de anillo en leche</div> <div style="text-align: left;">ELISA Indirecto</div> <div style="text-align: left;">ELISA por competición / bloqueo</div> <div style="text-align: left;">Ensayo de Polarización Fluorescente <br />Fijación de complemento</div> <div style="text-align: left;">Normativa vigente</div> <div style="text-align: left;">Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis</div> <div style="text-align: left;">Anexo I Lavado y desinfección de manos</div> <div style="text-align: left;">Anexo II Modelo de Planilla de emisión de resultados</div> <div style="text-align: left;">Bibliografía</div> Brucelosis Laboratorios https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/9934766422b4d917444569033829427d.pdf 29c39504c092e2a865f7d16170a0b4bc PDF Text Text �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Nuevo Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2019 Relation A related resource Resolución 67/2019 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0090 Abstract A summary of the resource. Folleto informativo sobre el Nuevo Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina, establecido por la resolución SENASA N° 67/2019, que indica que se debe efectuar el DOES y como actuar según su resultado. Brucelosis https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/b9e760682e8b8a36c94ccc47d8ea7177.pdf 4a6328c50b23f3a0a3c97eac0ed74400 PDF Text Text INFORME DEL MUESTREO PARA DETERMINACIÓN DE PREVALENCIAS DE BRUCELOSIS BOVINA EN LA ZONA DE MAYOR PRODUCCIÓN BOVINA EN LA REPUBLICA ARGENTINA AÑO 2014 Dirección de Programación Sanitaria Dirección de Epidemiologia y Análisis de Riesgo Dirección Nacional de Sanidad Animal �Introducción La brucelosis es una enfermedad contagiosa zoonótica con importancia para la salud pública y la economía agropecuaria en la mayoría de los países en desarrollo. La permanencia de esta enfermedad limita las posibilidades del sector pecuario y la comercialización internacional, influyendo negativamente en la rentabilidad de las explotaciones, en la calidad de los productos, en el consumo y en la salud pública. La brucelosis es una enfermedad de animales sexualmente maduros. Los animales jóvenes son muy poco susceptibles y es muy raro observarla por debajo de los seis meses de edad. Si bien estos animales pueden infectarse por el calostro y por la leche, la infección se acantona en los ganglios y se elimina espontáneamente, en la mayoría de los casos. En el ganado bovino la brucelosis suele estar causada por Brucella abortus. En algunos países, particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se asocia con ovejas o cabras, la infección puede ser también debida a B. melitensis. En ocasiones, B. suis puede causar una infección de las mamas en el ganado bovino, aunque no se ha descrito que origine abortos. Normalmente la enfermedad es asintomática en hembras no gestantes. Después de la infección por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestación desarrollan una placentitis que conduce al aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Aunque este signo puede no producirse en cierto porcentaje de los animales. Aun en ausencia de aborto se produce en el parto gran excreción de microorganismos a través de la placenta, los líquidos fetales y las descargas vaginales. Las mamas y los ganglios linfáticos asociados también pueden infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan por lo general a término, pero la infección uterina y la mamaria se repiten, con un número reducido de microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo está presente en la mayoría de los ganglios linfáticos. Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar esterilidad en ambos sexos. La forma principal de contagio es por vía digestiva, esta se produce cuando los animales lamen fetos abortados, terneros recién nacidos y/o los genitales de otros animales. También es importante la ingestión de alimentos y bebidas contaminadas con secreciones �vaginales y leche de hembras enfermas. La vía genital puede ser importante solo si se realiza inseminación artificial con semen infectado, de lo contrario, la brucelosis bovina no es una enfermedad venérea. El semen de un toro infectado puede contener grandes cantidades de brucelas pero sin embargo no contagia a la vaca, debido a que la acidez de la vagina contribuye a destruirlas. En el ser humano causa una dolencia llamada a menudo fiebre ondulante o fiebre de Malta, pues fue descripta por primera vez en Malta en el decenio de 1850. El ser humano presenta síntomas tales como fiebre intermitente o irregular, cefalea, debilidad, sudor abundante, escalofríos, artritis, pérdida de peso y dolor general. También puede producirse la infección de órganos como el hígado o el bazo. El impacto productivo y zoonótico de la brucelosis hace que sea considerada de suma importancia para la implementación de planes de control y erradicación. La mayoría de los países desarrollan acciones tendientes a disminuir los problemas que esta enfermedad provoca. Los países han fijado sus propias estrategias respecto a la lucha contra la brucelosis a través de programas con metas establecidas y realizando acciones planificadas, sostenidas en el tiempo y en base a los recursos disponibles. Pero las líneas de acción han respetado las normas sanitarias básicas establecidas, es decir, el modo general por el cual se alcanzan los objetivos y metas determinadas. La estrategia de los procedimientos biológico-sanitario de los programas de lucha contra la Brucelosis Bovina se basan principalmente en:  Estudios de la prevalencia. (Diagnostico de Situación)  Vacunación (Disminución de la susceptibilidad)  Eliminación de animales enfermos (Reducción de la oferta brucélica)  Pesquisa sanitaria (detección de animales reaccionantes y los rodeos de donde provienen)  Cuarentena de los rodeos infectados en la etapa erradicativa (se evita el contagio de rodeos sanos) El Cuarto Informe de Expertos en Brucelosis Ginebra 1964 Comité Mixto FAO/OPS aconseja que la lucha contra la Brucelosis bovina y su erradicación puede emprenderse �teniendo en cuenta el nivel de prevalencia de los rebaños y animales para definir las estrategias. El primer paso para definir la estrategia de elección debe estar basado en función de los niveles de enfermedad, el conocimiento de los niveles de prevalencia de brucelosis es el indicador de importancia para sentar las bases de las estrategias elegidas como también para evaluar los avances en los planes, verificar el estado sanitario del país e identificar zonas afectadas. En la República Argentina durante los últimos años se han efectuado diferentes trabajos de investigación con el objeto de arribar a esta determinación. La Dirección Nacional de Sanidad Animal, entre los años 2004 / 2005, realizó una encuesta por muestreo en conjunto con fiebre aftosa habiéndose muestreado en esa oportunidad 18.000 animales, lo que permitió ajustar los procedimientos utilizados. Este estudio demostró una prevalencia animal de 2,15 % a nivel país y una prevalencia de establecimientos del 12,4 %. Existen otros trabajos realizados por las Direcciones de Ganadería o Entes Sanitarios que actúan en los planes de fiebre aftosa que también han efectuado diversas encuestas que abarcan uno o más partidos o departamentos enteros de cada provincia y en algunos casos la provincia en su totalidad, en los cuales se observan bajas prevalencias en general. Un muestreo realizado en 2010, financiado por el Ministerio del Campo de la provincia de San Luis y el Senasa, cuyo objetivo fue estimar la prevalencia y la distribución espacial de la brucelosis bovina en vacas de cría adultas de las provincias de La Pampa y San Luis arrojó valores de prevalencia del 2.3 % de los animales y el 26 % de los predios positivos en La Pampa y 1.4 % de los animales y el 15.5 % de los predios positivos en San Luis. Dado que se han realizado numerosas acciones para controlar la enfermedad, como las campañas de vacunación en simultáneo con fiebre aftosa, el control de movimientos y el saneamiento de rodeos, es necesario evaluar el impacto que estas acciones han tenido sobre la prevalencia de brucelosis bovina en la República Argentina. Es esperable que dada la continuidad del plan, las prevalencias tanto animal como predial hayan descendido sensiblemente en los últimos años. Basado en el interés de adecuar las acciones del Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis Bovina (Resolución Senasa Nº 150/2002) y suponiendo que existe una baja �tasa de animales positivos a la enfermedad, se plantea “si las condiciones pudieran ser adecuadas para iniciar una etapa erradicativa”. Dado que el trabajo de saneamiento debe ser realizado sobre los establecimientos positivos es importante conocer qué proporción de establecimientos son los que se encuentran infectados. Objetivo El objetivo del presente trabajo es estimar la prevalencia animal y de predios infectados de brucelosis bovina en establecimientos de cría y mixtos en la zona de mayor producción bovina de la República Argentina. Materiales y métodos Marco del muestreo La población objetivo del muestreo son los establecimientos de cría, ya que los tambos y cabañas han realizado acciones de control de brucelosis bovina más específicas que permitieron certificar el 60 % de los tambos del país como libres de la enfermedad. Se identificó a los establecimientos de cría en base a la relación novillo/vaca de las existencias de cada campo. Se asumió que los establecimientos de cría corresponden a aquellos con una relación novillo/vaca inferior a 0,8. El 91,22 % del total de establecimientos con bovinos se encuentran en las provincias de Buenos Aires, Chaco, Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, Formosa, La Pampa, Salta, San Luis, Santa Fe y Santiago del Estero. En el Mapa 1 se ven con colores cálidos (rojo, naranja y amarillo) las zonas con mayor concentración de bovinos y en colores fríos (rosa, violeta y azul) las zonas con menor concentración de bovinos, incluyendo todos los establecimientos con al menos un bovino, sin importar su tipo productivo. Las zonas sin color tienen una concentración muy baja de bovinos, por lo que no serán tenidas en cuenta para este muestreo. En el Mapa 2 se ve la concentración de vacas en predios de cría. Las zonas más oscuras es donde hay mayor concentración de vacas en rodeos de cría. Las zonas más claras �tienen menor concentración de vacas en rodeos de cría y las zonas en blanco es donde la concentración de vacas en rodos de cría es demasiado baja como para ser contempladas en el muestreo. Mapa 1 Mapa 2 El muestreo se realizó en la zona del país con mayor concentración de establecimientos de cría. Diseño del muestreo Para calcular el número y tipo de animales por predio a muestrear se realizó un diseño en dos etapas. En la primera etapa se determinó el número de animales por establecimiento que deben muestrearse para detectar la presencia del evento en el establecimiento. Se asumieron los siguientes parámetros:  Nivel de confianza: 95 %  Máxima probabilidad aceptada de cometer error de Tipo II: 0,05  Mínima prevalencia esperada de animales positivos: 7,5 %  Cantidad promedio de animales: 300  Método diagnóstico: Tamiz BPA - Confirmatoria SAT �Sensibilidad Especificidad Prueba diagnóstica 1 95,4% 97,7% Prueba diagnóstica 2 88,4% 91,5% Combinación En serie Con estos parámetros, es necesario muestrear 42 animales por rodeo. A los efectos de disminuir la probabilidad de clasificación errónea de predios negativos y positivos, siendo la categoría a muestrear hembras de más de 24 meses (vacas). En la segunda etapa se determinó el número de predios a muestrear por provincia. Se asumieron los siguientes parámetros:  Prevalencia estimada: 10 %  Error relativo aceptado: 20 %  Nivel de confianza: 95 %  Tamaño de la población: 90.000 establecimientos de cría en todo el país Es necesario muestrear 857 establecimientos, lo que resulta en un total de muestras a obtener (predios x animales por predio) de 35.994 sueros bovinos. Los predios se seleccionaron al azar y el sorteo se realizó en dos etapas. Para calcular el número de muestras a tomar por provincia se efectuó un sorteo proporcional a la cantidad de establecimientos de cría por provincia incluida en el marco muestral (Tabla 3). Luego se distribuyeron la cantidad de muestras de cada provincia de manera uniforme según el tamaño del establecimiento (Tabla 4). Por último cada veterinario seleccionó al azar las vacas a muestrear en cada predio. �Tabla 1 BUENOS AIRES Proporción de establecimientos de cría y mixtos (%) 32 CHACO 9 73 CORDOBA 9 75 CORRIENTES 8 72 ENTRE RIOS 13 110 FORMOSA 5 44 LA PAMPA 5 42 SALTA 3 23 SAN LUIS 3 29 SANTA FE 10 85 SANTIAGO DEL ESTERO 4 31 Total 100 857 Provincia Establecimientos a Muestrear 272 Tabla 2 Provincia BUENOS AIRES CHACO CORDOBA CORRIENTES ENTRE RIOS FORMOSA LA PAMPA SALTA SAN LUIS SANTA FE SANTIAGO DEL ESTERO Total De 1 a 40 vacas 91 24 25 24 37 15 14 8 10 28 De 40 a 100 vacas 91 24 25 24 37 15 14 8 10 28 Más de 100 vacas 91 24 25 24 37 15 14 8 10 28 Establecimientos a Muestrear 273 72 75 72 111 45 42 24 30 84 10 10 10 30 286 286 286 858 Interpretación de los resultados Todas las muestras obtenidas fueron analizadas en el laboratorio de SENASA y procesadas en una primera instancia con una prueba tamiz utilizando la técnica de BPA (Buffered Plate Antigen, por sus siglas en ingles), los negativos a esta prueba se consideran negativos y los sueros positivos a BPA fueron analizados por la técnica confirmatoria SAT �(Sero Aglutinación en Tubo), los negativos a esta prueba se consideran negativos y los positivos son interpretados como positivos. Como se muestra en la Figura 1. Figura 1 Cascada Diagnostica Resultados Prevalencias En total, de los 30.508 animales muestreados, 246 resultaron positivos. La prevalencia animal es de 0.0081 (IC 95%= 0.0056; 0.0105) con una tasa de homogeneidad de 0.1306. De los 810 predios muestreados, 100 resultaron positivos. La prevalencia de establecimientos es de 0.1235 (IC95%=0.1009; 0.146). Tabla 3. Prevalencias Animales muestreados Animales positivos Prevalencia Animal % 30.508 246 0.81% IC% Predios muestreados Predios positivos Prevalencia interpredial % IC% 0.56 % 1.05 % 810 100 12.35 % 10% 14% Todos los establecimientos muestreados se han georreferenciado en el Mapa 3 identificando los negativos en negro y los positivos en rojo. �Mapa 3. Establecimientos Muestreados Frecuencia de los positivos El número de animales positivos por predio vario entre 1 y 16, con una media de 2.86 animales positivos por predio y un modo de 1 animal positivo por predio. En 24 establecimientos (24 %) se detectaron más positivos que los que indica la media. Grafico 1 �Mapa 4. Establecimientos con positivos mayor a la media Prevalencias por Provincia Se ha realizado una discriminación por provincias para estimación de prevalencias específicas, pero deben observarse como una aproximación ya que en algunas, los establecimientos muestreados son insuficientes para hacer el cálculo correspondiente, ya que el diseño de este muestreo fue realizado para una zona y no en particular para de cada una de las provincias. En la tabla 7 se detallan los resultados por provincia y en el Mapa 5 y 6 la prevalencia animal e interpredial de las mismas. Tabla 4. Prevalencias por Provincia Provincia Buenos Aires Chaco Córdoba Corrientes Entre Ríos Formosa La Pampa Salta San Luis Santa Fe Santiago del Estero Total Animales Muestreados Animales Positivos Prevalencia Animal % Establecimientos Muestreados Establecimientos Positivos Prevalencia predial % 10265 105 1.02 263 39 14.83 2510 2651 2697 3617 1290 1709 719 1188 2993 16 29 12 18 17 4 3 2 37 0.6 1.09 0.4 0.5 1.32 0.23 0.42 0.17 1.24 69 70 71 105 37 42 23 30 78 8 9 8 13 5 3 3 2 7 11.59 12.86 11.28 12.38 13.55 7.14 13.04 6.67 8.97 869 3 0.35 22 3 13.64 30.508 246 0.81 810 100 12.35 �Mapa 5. Mapa de prevalencia animal por provincia. Mapa 6. Mapa de prevalencia inter predio por provincia. Los resultados de prevalencia obtenidos (Prev. Animal 0.81 % y Prev. de Predios 12.35 %) son en base a las zonas consideradas para el estudio y deben interpretarse como valores referidos para las misma. Las prevalencias para provincias específicas no fueron objeto de este estudio y fueron calculadas solo con fines orientativos. �Análisis Espacial En este estudio se realizó un análisis espacial a fin de identificar agrupamientos, es decir, áreas geográficas con mayor frecuencia de casos que la esperada si la distribución fuese aleatoria. Se utilizó la técnica de rastreo espacial (spatial scan statistic en inglés) implementada en el programa SatScan (SatScan User Guide, 2010), y para identificar agrupamientos de predios positivos se utilizó el modelo de Bernoulli. Si bien se detectaron 3 posibles clústeres, al observar el p-valor superior a 0.05 los mismos no fueron considerados como significativos. Los resultados obtenidos indicaron que no existe un agrupamiento espacial de los casos, es decir que no pudo identificarse ningún clúster de agrupamiento, lo cual hace suponer que en este muestreo los establecimientos positivos a brucelosis se encuentran distribuidos en forma homogénea dentro de la zona en estudio. Puede observarse en el Mapa 7 la distribución espacial de los predios positivos. Mapa 7. Establecimientos positivos �Análisis de movimientos Al no encontrar un agrupamiento espacial se determinó la influencia de los movimientos de animales en la zona estudiada. Para esto se analizó el volumen de los movimientos tanto de salida (out-degree) como de entrada (in-degree) durante el periodo comprendido entre los años 2012 y 2013 de los establecimientos muestreados (Mapas 8 y 9) Mapa 8. Salidas Mapa 9. Entradas �Es reconocido que los predios positivos son fuente de animales infectados, es por esto que el ingreso y egreso de animales son la principal causa de la diseminación de la enfermedad y los animales el vehículo de ingreso a los establecimientos negativos. En los Mapas 10 y 11 puede observarse la amplia red de movimientos tanto de entrada como de salida que se registra durante los años 2012 y 2013 en los establecimientos muestreados. Mapa 10. Movimientos geo referenciados del ingreso de bovinos durante el periodo 2012 - 2013 a los predios muestreados Mapa 11. Movimientos geo referenciados del egreso de bovinos durante el periodo 2012 - 2013 de los predios muestreados. Para visualizar más claramente se exponen a continuación en el Mapa 12 solo los establecimientos positivos. Este mapa nos permite observar la probable difusión de la enfermedad, dado el riesgo que implica el movimiento de animales desde estos predios evidenciando la necesidad de identificar los mismos para restringir sus movimientos evitando la diseminación de la enfermedad. �Mapa 12. Movimientos de salida desde los establecimientos muestreados con resultados positivos. Puede observarse que estos movimientos no sólo son intraprovinciales sino también entre provincias lo que hace significativo el efecto del traslado de los animales y la amplia distribución que podrían alcanzar los animales positivos. El análisis de los movimientos de ingresos (in-degree) y egresos (out-degree) se realizó usando el programa Microsoft Access 2007 (Microsoft, Redmond, USA) sobre datos de SIGSA durante el 2012 y 2013. Los predios incluidos en el muestreo y los predios positivos se representaron en mapas realizados con el programa ArcGIS versión 10.2 (ESRI). Los ingresos y egresos de bovinos a los predios muestreados se graficaron mediante el programa ArcGIS versión 10.2 (ESRI). �Análisis de Encuestas Acompañando el muestreo se realizó conjuntamente una encuesta destinada a identificar posibles factores de riesgo que pudieran asociarse a la presencia o ausencia de la enfermedad en los rodeos. En primer lugar se realizó un análisis general del grado de respuesta de las encuestas. Si bien se tomaron muestras de 811 establecimientos, se recibieron 794 encuestas. Y solo se pudieron analizar 770, que representan el 95 % de los establecimientos muestreados, debido a que 24 encuestas presentaban inconsistencias al asociarlas con los establecimientos muestreados y fueron descartadas. Se detalla en la Tabla 8 y Grafico 2 a continuación el grado de respuesta para cada ítem de la encuesta: Grafico 2. Grado de respuesta por pregunta Dado que el objetivo principal del muestreo es estimar la prevalencia de predios positivos a brucelosis bovina en establecimientos de cría, los resultados de las encuestas se analizaron respecto al estado sanitario del predio determinado por el muestreo (variable respuesta), buscando identificar factores de riesgo que pudiesen estar asociados a la presencia de la enfermedad. �Ninguna de las variables estudiadas pudo ser identificada como un factor de riesgo que justifique la presencia de la enfermedad. Para el caso de los diferentes tipos de reposición dado que se evaluaron las opciones reposición interna, compra de animales de otros establecimientos o ambas y no se detectó ninguna diferencia significativa, se realizó el análisis comparando únicamente la reposición interna con la compra de animales. En este caso tampoco se detectó ninguna diferencia significativa entre los grupos. Sin embargo en el 20 % (88/456) de las encuestas el productor declara realizar únicamente reposición interna y luego responde que realiza diagnóstico a los animales que compra. Si se eliminan estos registros tampoco se detectan diferencias estadísticas entre los grupos, ni tampoco si consideramos a quienes respondieron que realizan análisis en la compra como que realizan reposición externa. El hecho de no realizar un diagnóstico previo a la compra tampoco demostró ser un factor de riesgo. El 63 % (424/675) de los establecimientos encuestados no realizaban análisis previo a la compra de animales. Y de los establecimientos que si realizan diagnósticos previo a la compra el 10 % (24/251) tienen la enfermedad. Para profundizar el análisis se definen 3 nuevos grupos, en base a lo respondido en las encuestas: establecimientos que realizan reposición interna, establecimientos que compran animales y realizan un diagnóstico en la compra, y establecimientos que compran animales sin realizar diagnóstico. Entre estos grupos tampoco se detectan diferencias significativas. Con respecto a las acciones que se realizan cuando un animal se detecta como positivo, no se detectó diferencia significativa entre las opciones de segregación, envío a faena o conservación del animal en el predio. Discusión y Conclusión En el muestreo realizado en el año 2004 se observaron valores de prevalencia animal de 2.15 % y de prevalencia de predios del 12.4 %. Si bien el diseño y las cantidades de muestras de aquel estudio fueron diferentes a este trabajo realizado en 2014 se toma como referencia ya que abarcó una zona similar En aquel estudio la cantidad de muestras por predio no fue la más indicada para detectar predios infectados, dado que el diseño de selección de establecimientos y �capacidades operativas correspondían a un diseño realizado para fiebre aftosa y esto podría haber resultado en una subestimación de la prevalencia de predios. Tabla 5. Muestreo 2004 Animales Animales Prev Establecimientos Establecimientos Muestreados Positivos Animal % Muestreados Positivos 18.471 397 2.15 1.847 Prev Estab % 229 12.4 En el estudio 2014 se puede observar que la prevalencia animal obtenida es de 0.81 %, lo que indica una disminución de la prevalencia en 10 años estadísticamente significativa (p<0.05). Estos valores son coincidentes con una situación epidemiológica donde la vacunación sistemática y continua de las terneras a lo largo de los años puede haber actuado como factor relacionado a la disminución de la prevalencia de la enfermedad. Esto hablaría de una eficacia en las campañas de vacunación y su efectividad para el control constante que produce sobre la enfermedad. También se puede asumir que si bien no ha existido una presión de saneamiento sobre los establecimientos infectados estos han eliminado a los animales positivos. En el muestreo 2014 si bien la prevalencia animal es baja, la prevalencia de predios se mantiene en los mismos valores que en 2004. Esto significa que la misma proporción de establecimientos aún mantienen al menos un animal positivo dentro del establecimiento, que se transforma en la fuente de infección tanto de los animales del mismo rodeo como de otros establecimientos. Es importante considerar que el número de animales positivos por predio vario entre 1 y 16, con una media de 2.86 animales positivos por predio y un modo de 1 animal positivo por predio, lo cual refuerza la hipótesis de que sigue habiendo la misma proporción de establecimiento afectados pero con pocos animales positivos dentro del rodeo. Que la prevalencia predial se haya mantenido constante respecto al muestreo del 2004 (habiendo mencionado arriba la consideración sobre aquel estudio) podría significar que no ha existido un saneamiento del todo efectivo en los establecimientos. Esto sería un indicador que los establecimientos no realizan saneamiento o lo realizan pero existen otros que se mantienen infectados y reintroducen la enfermedad en los establecimientos negativos. Esta idea se confirma al analizar los movimientos de egreso que se producen de los predios positivos. Si bien existe en el país un control de movimiento de animales, este estudio demostraría que este control debería realizarse de manera más estricta para poder evitar el �reingreso de animales positivos en establecimientos libres. El hecho de no encontrar agrupamientos de establecimientos positivos no permite identificar factores de riesgo asociados a cuestiones climáticas o geográficas. La distribución aleatoria de los predios afectados podría estar nuevamente relacionada al movimiento de animales positivos sin control sanitario previo. La encuesta tampoco permitió definir factores de riesgo. Sin embargo es importante notar que en algunos casos las respuestas no eran coherentes, por ejemplo algunos productores declararon realizar únicamente reposición interna y luego respondieron que realizaban diagnóstico a los animales que compraban. Esto pudo afectar los resultados del análisis. Los resultados comparados de los muestreos de 2004 y 2014 podrían conducir a la conclusión que la vacunación ha mantenido bajo control la brucelosis bovina, pero por sí sola es una herramienta insuficiente para erradicar la enfermedad. Es por esto que los niveles de prevalencia difícilmente puedan disminuir aún más sin modificar otras actividades de control de la brucelosis bovina. A fin de establecer nuevas acciones tendientes a mejorar el plan actual se plantea la necesidad de trabajar en tres líneas de acción principales:  Detectar los establecimientos positivos, la enfermedad se encuentra en los mismos por lo que cualquier actividad de saneamiento que se requiera realizar debe ineludiblemente y en primera instancia desarrollar un sistema de vigilancia para encontrarlos.  Restringir los movimientos de los establecimientos positivos, los predios positivos se transforman en la fuente de infección de otros establecimientos y establecer un control de movimientos efectivo sobre estos resulta fundamental para evitar la propagación de la brucelosis  Establecer el saneamiento de los establecimientos positivos, es evidente que la erradicación de la enfermedad se logrará al sanear estos establecimientos mediante la eliminación de los animales reaccionantes que se encuentran en el rodeo. Es importante determinar que dada la situación actual de prevalencia es posible iniciar una etapa erradicativa que debe establecerse por etapas y por el desarrollo de �actividades que acompañen este proceso. Si bien los niveles de prevalencia no son los únicos factores a evaluar para definir este objetivo, hay que considerar estos niveles de prevalencia como una oportunidad para alcanzar el objetivo final que han perseguido los planes de lucha contra la Brucelosis Bovina, su erradicación. � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Informe del muestreo para determinación de prevalencias de brucelosis bovina en la zona de mayor producción bovina en la República Argentina año 2014 Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2014 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección de Programación Sanitarias Dirección de Epidemiologia y Análisis de Riesgo Dirección Nacional de Sanidad Animal Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0087 Abstract A summary of the resource. La brucelosis es una enfermedad contagiosa zoonótica con importancia para la salud pública y la economía agropecuaria en la mayoría de los países en desarrollo. La permanencia de esta enfermedad limita las posibilidades del sector pecuario y la comercialización internacional, influyendo negativamente en la rentabilidad de las explotaciones, en la calidad de los productos, en el consumo y en la salud pública. El objetivo del presente trabajo es estimar la prevalencia animal y de predios infectados de brucelosis bovina en establecimientos de cría y mixtos en la zona de mayor producción bovina de la República Argentina. Brucelosis https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/07b9f2d2ac0ed36e8a0e141c5d54ed5e.pdf a79e24f39f5ffab52ca37fd0bba8daa3 PDF Text Text ZOONOSIS BRUCELOSIS CAPRINA CÓMO RECONOCERLA Y PREVENIRLA �BRUCELOSIS CAPRINA CÓMO RECONOCERLA Y PREVENIRLA ¿Cómo se transmite? Las cabras se infectan a través de la ingesta de agua y alimentos que contienen esta bacteria, por el consumo de leche materna (cabritos) o por el contacto con fluidos corporales de animales enfermos. Además, se transmite a las personas que atienden los corrales y están en contacto con cabras enfermas, partos, placentas y fluidos corporales. Otra fuente usual de infección es el consumo de leche cruda, quesillos y otros productos lácteos que, en su elaboración, utilizan leche sin pasteurizar o hervir. ¿Cuáles son los SIGNOS CLÍNICOS? En las personas: •dolor muscular, articular y de cabeza; •fiebre intermitente; •orquitis (inflamación de los testículos); •sudor nocturno con frío y escalofríos; •pérdida de apetito y de peso; •estreñimiento; •aumento de tamaño del bazo, hígado y ganglios linfáticos. En los animales: •abortos tardíos; •menor producción de leche; •presencia de coágulos en la leche; •retención de placenta; •infección uterina e infertilidad; •glándulas mamarias infectadas con pequeños nódulos. ¿Cómo prevenir el contagio en los humanos? En el trabajo con animales •Utilice guantes, botas de goma, anteojos y ropa adecuada. Si tiene heridas en la piel, protéjalas. •Limpie los elementos y desinfecte las herramientas del corral fuera del alcance de los animales. •Lave y desinfecte sus manos antes y después de trabajar en el corral. •No tome ni se higienice con agua que estuvo en contacto con animales. •No fume ni coma mientras trabaja y evite llevarse las manos a la boca. •Queme los restos de abortos o partos y entiérrelos en un pozo. �Es una enfermedad producida por la bacteria Brucella melitensis que genera problemas reproductivos y abortos en las cabras, y puede transmitirse al hombre provocando una enfermedad crónica. ¿Cómo actuar ante la sospecha o confirmación de la enfermedad? En los animales En provincias donde la brucelosis está presente, el Senasa promueve diferentes medidas para controlarla dependiendo de la situación de la misma en cada zona: diagnóstico de la enfermedad, aplicación de la vacuna Rev.1 en zonas endémicas y control de movimientos. Contáctese con el Senasa para notificar cualquier sospecha de enfermedad y recibir asistencia en el manejo sanitario de su producción. En las personas Si observa alguno de los signos clínicos mencionados, recurra al centro de atención médica más cercano para hacerse un chequeo. Recomendaciones para el empleo de la vacuna En la manipulación y el consumo de alimentos •Para destruir la bacteria que produce la brucelosis, antes de consumir la leche o preparar productos derivados de ella, debe hervirla o bien pasteurizarla, calentándola a 65°C durante 30 minutos y revolviendo frecuentemente. •No consuma quesos de procedencia dudosa o que no hayan sido elaborados con leche pasteurizada. •Aplicar la vacuna por vía conjuntival Rev. 1, utilizando una dosis completa por animal (1 gota). •Ejecutar la vacunación únicamente durante el preservicio, pasada la parición o durante la lactación. No está indicado el uso de la vacuna durante la preñez. •Realizar campañas masivas cada dos años y como mínimo durante un período de diez años. �La detección temprana y la notificación inmediata de casos de brucelosis caprina son fundamentales para la implementación de medidas de prevención, control y vigilancia por parte de los organismos competentes. Coordinación de Zoonosis del Senasa (011) 4121 -5000 brucelosiscaprina@senasa.gob.ar coorzoonosis@senasa.gob.ar � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Brucelosis caprina. Cómo reconocerla y prevenirla Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Coordinacion de Zoonosis Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0065 Abstract A summary of the resource. Informacion sobre como reconocer y prevenir la brucelosis caprina, que es una enfermedad producida por la bacteria Brucella melitensis que genera problemas reproductivos y abortos en las cabras, y puede transmitirse al hombre provocando una enfermedad crónica. Brucelosis Enfermedades de los Caprinos https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/74368eefd3f1086cafa81647794930bd.pdf c9712aa39efa585d7fd20c82b9e32472 PDF Text Text SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL Y CALIDAD AGROALIMENTARIA MANUAL SIGSA CARGA DE SEROLOGIA SISTEMA INTEGRADO DE GESTION DE SANIDAD ANIMAL CARGA DE SEROLOGIA DE BRUCELOSIS Dirección de Planificación y Estrategia en Sanidad Animal Mayo 2021 Versión 2. 2021 El siguiente documento tiene como finalidad brindarle al usuario una herramienta de capacitación que le facilite el trabajo con el Sistema Integrado de Gestión de Sanidad Animal (SIGSA) �OBJETIVOS DEL SISTEMA El objetivo de esta funcionalidad es brindar a los usuarios del sistema la opción de carga de los resultados de las serologías de brucelosis. MARCO NORMATIVO Resolución SENASA N° 67/2019 y resolución SENASA N° 77/2021 ¿QUIEN PUEDE CARGAR UNA SEROLOGIA? Puede cargar una serología el personal de la Oficina Local o el Veterinario Acreditado al programa de brucelosis bovina del RENSPA involucrado. REQUISITOS PARA LA CARGA DEL RESULTADO El Veterinario responsable debe tener cargado el rol de acreditado al programa de brucelosis, en el SUR. Esta acción es realizada por Senasa a través del registro de la realización de los cursos de acreditación o re-acreditación. El laboratorio debe estar registrado en el SUR, tener en cuenta que figuran con la razón social, y no con el nombre de fantasía. Este registro es realizado por Senasa a partir de los laboratorios inscriptos a la red nacional de laboratorios diagnósticos. INGRESO POR AFIP El veterinario acreditado debe ingresar a SIGSA a través de la página de AFIP con CUIT y clave fiscal. Previamente debe tener asociado el aplicativo SIGSA. (Ver Manual ADHESION DE SERVICIOS INTERACTIVOS CON CLAVE FISCAL AFIP) �CARGA DE LA SEROLOGIA En la pantalla principal de SIGSA, verificar que se encuentre en Vista Bovinos. Para ingresar una nueva serología se debe ingresar en la pestaña [Sanitario Sanitario], luego en [Brucelosis] y hacer click en [[Nueva Serología]. �En la siguiente pantalla el usuario deberá ingresar el RENSPA que solicita la carga de la serología. Una vez ingresado el RENSPA se habilitará la carga de los datos restantes: Desde el botón [BUSCAR] se despliegan las pantallas para seleccionar el Veterinario responsable y el Laboratorio de red. Veterinario Acreditado �Laboratorio de red Una vez ingresado el RENSPA, el veterinario y el laboratorio se ingresan el resto de los datos solicitados. Debe ingresarse motivo, fechas y número de protocolo como figura según el recibido por parte del laboratorio. �Luego se debe cargar la cantidad de animales muestreados, por categoría. . El sistema trae al momento de la carga las existencias de animales presentes a la fecha, como referencia. La cantidad de animales a registrar (según protocolo de diagnóstico) puede no coincidir con el stock de acuerdo al trabajo que se haya realizado, sobre todo cuando se trata de diagnósticos parciales como DOES MUESTREO, controles de movimientos, saneamientos. El sistema advertirá esta situación, solo se debe continuar. �Una vez ingresada la información necesaria, presionar el botón [[GENERAR GENERAR], el sistema informara la creación del certif certificado. CARGA DE POSITIVOS Para realizar la carga de serologías con animales positivos se deben seguir los mismos pasos indicados arriba, al momento de registrar la cantidad de animales se deben informar la cantidad de positivos. �Al registrar alguna cantidad de animales positivos el sistema requerirá que se consignen las caravanas positivas y no permitirá continuar hasta que las mismas se registren adecuadamente en cantidad y número oficial de caravana. Las caravanas deben registrarse con los car caracteres acteres correspondientes al CUIG (dos letras y tres números) y al número de manejo (una letra y tres números) y sin el digito verificador. En total 9 caracteres los cuales deben escribirse todos juntos. Para separar las distintas caravanas positivas se debee utilizar solo un espacio. �Una vez generado el certificado de carga de serología el sistema permite realizar una impresión del certificado. �IMPORTANTE La carga de la serología en SIGSA se utiliza para volcar la información al sistema de las distintas acciones de diagnostico bajo plan. Las mismas pueden ser por distintos motivos como DOES, Saneamientos, os, Vigilancia, Certificado de sseronegatividad eronegatividad para el movimiento. La carga de estas serologías no implica que automáticamente el establecimiento se le haya generado un registro de estatus sanitario como ser el “LIBRE”, “NEGATIVO” o “BAJO SANEAMIENTO”. Este registro se encuentran limitados a las oficinas locales de Senasa. Por lo cual para asignar un ESTATUS SANITARIO a partir de la SEROLOGÍA registrada registrada, se debe dar aviso a la misma para verificar los datos consignados y la oficina local registrará el estatus sanitario según corresponda. Asimismo la oficina local de forma rutinaria o aante nte inconsistencias podrá requerir la presentación de los protocolos diagnósticos originales emitidos por los laboratorios. �SOPORTE TÉCNICO-MESA DE AYUDA DEL SIGSA-CONTACTO Para cualquier duda o consulta pueden comunicarse con la mesa de ayuda de SIGSA. Horario de atención telefónica de lunes a viernes de 8 a 17 hs Teléfonos: (011) 4121-5374/5634/5252/5415 Corporativos: #1340 / #1900 / #2111/#2303 Guardias de fin de semana para urgencias de 8 a 20 hs al corporativo #1900 ((011)-15-40413614.) � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual SIGSA. Cargar de serologia. Sistema Integrado de Gestión de Sanidad Animal. Carga de Serologia de Brucelosis. Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2021 Relation A related resource Resolución SENASA N° 67/2019 Resolución SENASA N° 77/2021 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0050 Abstract A summary of the resource. Manual explicativo para brindar a los usuarios del sistema la opción de carga de los resultados de las serologías de brucelosis. Brucelosis SISTEMAS INFORMATICOS https://biblioteca.senasa.gov.ar/files/original/d1e5a02b06ea2ce3cc3bcdd2bf4bd4f2.pdf c7cb553fc8f9128547a430ec446077ef PDF Text Text La lectura del presente material es necesaria para la REACREDITACIÓN de Vacunadores. Introducción La brucelosis es una enfermedad infectocontagiosa, producida por la bacteria Brucella sp., que puede afectar a muchas especies de animales, particularmente a bovinos, cerdos, cabras, ovejas, camélidos, bisontes, alces, ciervos, caballos, caninos y otros mamíferos, en los bovinos es causada generalmente por Brucella abortus. Signos clínicos en animales Después de la infección, las bacterias se multiplican primero en los ganglios linfáticos regionales y luego se propagan a través de la sangre y del sistema linfático del animal, infectando diferentes órganos, especialmente los órganos reproductivos, glándulas mamarias, las articulaciones, bazo e hígado. Esto puede causar abortos, infertilidad y el nacimiento de animales débiles. En el ganado vacuno, el aborto es el principal signo clínico de la enfermedad entre el quinto y noveno mes de preñez. Después de que una vaca infectada aborta o pare normalmente, se produce una abundante excreción de microorganismos en el mismo aborto, en la placenta, fluidos fetales y descargas vaginales contaminando pastos y aguas. Luego la infección se vuelve crónica y las Brucellas se acantonan en los ganglios y glándulas mamarias de la vaca y la bacteria puede excretarse por leche. Las gestaciones siguientes generalmente llegan a término, pero la infección uterina y mamaria se repite. Los bovinos machos adultos pueden desarrollar orquitis (inflamación de los testículos) y la brucelosis puede ser una causa de infertilidad en ambos sexos. �La inflamación de las articulaciones (higromas) generalmente en las patas, son una manifestación común de brucelosis en algunos países tropicales y puede ser el único indicador de la infección. Fig. 1 Síntomas clínicos Incubación de la enfermedad En infecciones naturales es difícil medir el período de incubación (desde la infección hasta el aborto o nacimiento prematuro), porque no se puede determinar el momento de la infección. Por experimentación se ha demostrado que el período de incubación es sumamente variable e inversamente proporcional al desarrollo del feto. Cuando más adelantada está la preñez, más corto será el período de incubación. ¿Cómo se transmite la enfermedad en animales? Los animales se infectan naturalmente por las mucosas, a través de la vía conjuntival, digestiva y respiratoria, La vía de invasión más frecuente es el tracto gastrointestinal, a través de la costumbre de lamer los órganos genitales, membranas fetales, fetos y terneros recién nacidos, que contienen todos ellos gran número de Brucellas. También �puede contribuir la contaminación del campo con estos materiales a través de la ingestión de pastos, forrajes y agua contaminados por Brucellas. En ambientes cerrados, con gran concentración de animales, la inhalación de polvo en suspensión es una vía muy importante de infección, sobre todo en tierras secas y desérticas. La vía intrauterina que se emplea en la inseminación artificial es muy importante en la transmisión de la infección en bovinos. El uso de toros infectados para inseminación artificial constituye un peligro importante. También esta demostrada la transmisión vertical de madre a terneros. Fig. 2: vias de eliminación Fig 3. Vías de infección �Brucelosis en las personas Esta enfermedad es una zoonosis es decir se transmite de los animales alaspersonas donde causa una enfermedad invalidante si no es tratada debidamente con antibióticos. El síntoma principal es la fiebre alta e intermitente y pueden presentarse dolores musculares de articulaciones, sudoración nocturna y decaimiento general. ¿Cómo es la transmisión al hombre? Las vías de transmisión al humano pueden resumirse en: • Contacto: de piel o mucosas con tejidos de animales infectados o sus productos como ganglios, sangre, orina, semen, secreciones vaginales, fetos abortados y en especial placentas. Este mecanismo es el más frecuente en el medio rural y puede llegar a ser el responsable del 60%-70% de todos los casos registrados. Afecta a trabajadores rurales, veterinarios, matarifes y ganaderos, aunque también puede afectar a trabajadores de laboratorios. •Ingestión: de alimentos no pasteurizados de origen animal, como leche y sus derivados (quesos, crema, manteca, helados). Fig. 4. Algunas fuentes de infección para el hombre �• Inhalación: de polvo en los lugares contaminados donde hay animales infectados, como establos, mataderos, salas de recepción de leche, camiones jaula para transporte de ganado, en el laboratorio por procedimientos de centrifugación, etc. • Inoculación accidentalPor uso descuidado de la cepa vacunal. Este tipo de transmisión afecta a veterinarios, personal de laboratorio y vacunadores Prevención La forma adecuada para evitar la infección es el manejo adecuado de los animales utilizando los elementos de protección personal cuando sean necesarios, como botas, overol, guantes y anteojeras. Trabajando de forma ordenada y sin apuros, no comer, ni fumar mientras se trabaja y lavarse las manos frecuentemente o utilizar desinfectantes. En el manejo de la vacuna evitar la generación de aerosoles en su reconstitución o descarga de la jeringa y realizando la aplicación a conciencia y sin apuros. Realizar el descarte de los materiales utilizados adecuadamente por incineración en el lugar de trabajo o a través de los procedimientos dispuestos por el Ente. �La Vacunación antibrucélica La vacunación de las terneras es la principal herramienta de control contra la enfermedad, la aplicación de la vacuna sobre las terneras una sola vez confiere inmunidad duradera para los animales adultos que entrarán a futuro en la reproducción. Los Entes Sanitarios son los que tienen a su cargo la planificación, coordinación y ejecución de todas las tareas inherentes a cada campaña oficial de vacunación antibrucélica, �La estrategia de vacunación solo resulta efectiva cuando es aplicada de forma sistemática y de forma masiva a todas las terneras y cunado es aplicada a lo largo de los años alcanzado un rodeo general protegido comienza a disminuir paulatinamente los niveles de prevalencia. Es por esto que resulta de suma importancia realizar esta tarea adecuadamente ya que en ella se sostiene el control fundamental de la enfermedad. La vacuna a utilizar es la cepa 19, todas las series de vacuna producidas en el país son controladas por el laboratorio central de SENASA. Hoy la normativa vigente, Resolución 67/ 2019 establece la obligación de vacunar a todas las terneras del país entre los 3 y 8 meses de edad, es importante destacar que debe respetarse este periodo de aplicación para evitar que la vacuna interfiera con las pruebas diagnósticas que se realizan en los animales o evitar revacunaciones de animales que ya han sido vacunados previamente. Para evitar estas revacunaciones y observar facialmente en el trabajo a campo cuales han sido vacunadas Las terneras deben identificarse como tales mediante marca, señal, tatuaje, caravana o algún otro método visible. El método de identificación a utilizar debe ser fehacientemente notificado al SENASA. Esto debe ser definido por el Ente o en caso de no estar definido puede elegirse un método por parte del productor. Para realizar una correcta vacunación  Contar con la indumentaria apropiada y elementos de protección personal  Disponer de 2 jeringas metálicas automáticas y agujas de uso exclusivo para la vacuna antibrucélica  Verificar el estampillado del frasco y vencimiento � No usar desinfectante sobre los tapones de goma y reconstituir según las instrucciones del fabricante.  El diluyente debe ingresar en el frasco con el liofilizado por vacío, si esto no sucede debe comunicarse al SENASA.  Agitar suavemente hasta la dilución completa y dejar reposar 10 minutos antes de aplicar.  La vacuna se puede utilizar hasta 3 horas después de reconstituida y debe ser mantenida refrigerada y al abrigo de la luz  Se debe aplicar por vía subcutánea detrás de la paleta, solo a las terneras de 3 a 8 meses de edad  Finalizada la vacunación descartar las ajugas, frascos y material descartable utilizado y quemarlo en las mismas instalaciones o disponer de los mismos según los procedimientos de manejo de material patológico establecidos por el Ente.  Completar la planilla de vacunación simultánea correspondientes a la vacunación antibrucélica con los datos � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Módulo V: Brucelosis - Introducción Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2020 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0101 Abstract A summary of the resource. Módulo diseñado para el curso de Reacreditación de Veterinarios privados. El presente módulo (Nº 5) correspondiente a Fiebre Aftosa, ofrece una breve descripción de la Brucelosis, a modo de información complementaria de utilidad. Se explican signos clínicos del animal, incubaciòn, vías de transmición en animales y en humanos. Señala indicaciones para realizar una correcta vacunación antibrucélica. Brucelosis